Smirnov, Oleh Yuvenaliiovych

Смирнов, Олег Ювенальевич

Смірнов, Олег Ювеналійович

Electronic Sumy State University Institutional Repository

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НИТРОЗОГУАНИДИНА В КАЧЕСТВЕ ИНДУКТОРА МУТАЦИЙ, УСИЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРОМОТОР Смирнов О. Ю. СумГУ, кафедра физиологии и патофизиологии с курсом медицинской биологии  Промоторы бактериальных генов имеют разнообразную структуру, но для изучения принципов формирования комплекса РНК-полимераза–промотор недостаточно исследовать природные промоторы. Эффективным средством может быть изучение индуцированных мутаций, повышающих или понижающих экспрессию генов. Силу промотора удобно оценивать по устойчивости бактериального штамма к антибиотику, если между уровнем такой устойчивости и уровнем экспрессии соответствующего гена имеется прямая зависимость (хотя бы в определённом интервале). Примером такого гена-мишени может быть ген устойчивости к тетрациклину. N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (короткое название – нитрозогуанидин) – алкилирующий канцероген достаточно простой структуры: CH3–N(NO)–C(NH)–NH–NO2, с мол. массой 147,09. Он вызывает метилирование аденина и гуанина в ДНК и последующую апуринизацию. Нитрозогуанидин широко используется в экспериментах для получения индуцированных мутаций. Нами были подобраны условия экспериментального получения промоторных мутаций в гене устойчивости к тетрациклину. Мутагенная обработка культур Escherichiacoli, несущих плазмиды, производные от pBR322 и содержащие ген устойчивости к тетрациклину (неизменённый или видоизменённый), проводилась следующим образом. К бульону Хоттингера приливали 1/50 объёма ночной культуры E. coli, подращивали до оптической плотности 0,6, разливали по 2,5 мл в несколько пробирок. В опытные пробирки добавляли раствор нитрозогуанидина в цитратном буфере (0,1 М цитрат натрия, pH 5,5) до конечной концентрации 10–20 мкг/мл. Подращивали на качалке 2 часа при 37°, высевали по 0,05–0,1 мл на агар с тетрациклином. Контролем служила культура, не обработанная мутагеном. Было обнаружено, что концентрации нитрозогуанидина 10 и 15 мкг/мл действуют приблизительно одинаково и существенно не снижают жизнеспособность бактерий в сравнении с контролем, а концентрация 20 мкг/мл уменьшает число жизнеспособных клеток примерно в 20 раз, причём число клеток, устойчивых к тетрациклину, также снижается более чем в 5 раз. Таким образом, оптимальной концентрацией мутагена является концентрация 10 мкг/мл нитрозогуанидина. Частота образования спонтанных мутаций устойчивости к тетрациклину в штамме C600, несущем плазмиду, составляла около 10–8. Частота мутаций, индуцированных нитрозогуанидином, составила 10–4 (дополнительные исследования нескольких полученных мутаций показали, что они произошли в плазмидах), причём в другом контроле, при обработке мутагеном штамма C600, не несущего плазмиды, частота образования Tetr-колоний (т.е. хромосомных мутаций) была около 10–6.  

Использование нитрозогуанидина в качестве индуктора мутаций, усиливающих бактериальный промотор

SocioEconomic Challenges Journal (Sumy State University)

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НИТРОЗОГУАНИДИНА В КАЧЕСТВЕ 
ИНДУКТОРА МУТАЦИЙ, УСИЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРОМОТОР 
Смирнов О. Ю. 
СумГУ, кафедра физиологии и патофизиологии с курсом медицинской биологии 
 
Промоторы бактериальных генов имеют разнообразную структуру, но для изучения принципов 
формирования комплекса РНК-полимераза–промотор недостаточно исследовать природные промоторы. 
Эффективным средством может быть изучение индуцированных мутаций, повышающих или понижающих 
экспрессию генов. Силу промотора удобно оценивать по устойчивости бактериального штамма к антибиотику, 
если между уровнем такой устойчивости и уровнем экспрессии соответствующего гена имеется прямая 
зависимость (хотя бы в определённом интервале). Примером такого гена-мишени может быть ген устойчивости 
к тетрациклину. 
N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (короткое название – нитрозогуанидин) – алкилирующий 
канцероген достаточно простой структуры: CH3–N(NO)–C(NH)–NH–NO2, с мол. массой 147,09. Он вызывает 
метилирование аденина и гуанина в ДНК и последующую апуринизацию. Нитрозогуанидин широко 
используется в экспериментах для получения индуцированных мутаций. 
Нами были подобраны условия экспериментального получения промоторных мутаций в гене 
устойчивости к тетрациклину. Мутагенная обработка культур Escherichiacoli, несущих плазмиды, производные 
от pBR322 и содержащие ген устойчивости к тетрациклину (неизменённый или видоизменённый), проводилась 
следующим образом. К бульону Хоттингера приливали 1/50 объёма ночной культуры E. coli, подращивали до 
оптической плотности 0,6, разливали по 2,5 мл в несколько пробирок. В опытные пробирки добавляли раствор 
нитрозогуанидина в цитратном буфере (0,1 М цитрат натрия, pH 5,5) до конечной концентрации 10–20 мкг/мл. 
Подращивали на качалке 2 часа при 37°, высевали по 0,05–0,1 мл на агар с тетрациклином. Контролем служила 
культура, не обработанная мутагеном. Было обнаружено, что концентрации нитрозогуанидина 10 и 15 мкг/мл 
действуют приблизительно одинаково и существенно не снижают жизнеспособность бактерий в сравнении с 
контролем, а концентрация 20 мкг/мл уменьшает число жизнеспособных клеток примерно в 20 раз, причём 
число клеток, устойчивых к тетрациклину, также снижается более чем в 5 раз. Таким образом, оптимальной 
концентрацией мутагена является концентрация 10 мкг/мл нитрозогуанидина. 
Частота образования спонтанных мутаций устойчивости к тетрациклину в штамме C600, несущем 
плазмиду, составляла около 10–8. Частота мутаций, индуцированных нитрозогуанидином, составила 10–4 
(дополнительные исследования нескольких полученных мутаций показали, что они произошли в плазмидах), 
причём в другом контроле, при обработке мутагеном штамма C600, не несущего плазмиды, частота 
образования Tetr-колоний (т.е. хромосомных мутаций) была около 10–6. 
 


Russian

https://essuir.sumdu.edu.ua/bitstream/123456789/26973/1/Smirnov%20.pdf

Использование нитрозогуанидина в качестве индуктора мутаций, усиливающих бактериальный промотор

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Electronic Sumy State University Institutional Repository

SocioEconomic Challenges Journal (Sumy State University)