Genetic diversity of cryptococcus and candida isolates from Yaoundé HIV positive patients and study of their antifungal susceptibility against antifungal drugs and plant extracts

Abstract

Cryptococcus neoformans et les levures du genre Candida sont fréquemment impliqués dans les infections fongiques opportunistes chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Les données sur l'épidémiologie moléculaire et la sensibilité de ces levures aux antifongiques sont rares au Cameroun. Les objectifs de ce travail ont été (i) d'obtenir et caractériser génétiquement les isolats de Cryptococcus et de Candida issus des PVVIH à Yaoundé, (ii) d'étudier leur profil de sensibilité à divers antifongiques, (iii) d'étudier l'activité antifongique des extraits de 3 plantes médicinales (Terminalia mantaly, Terminalia catappa et Monodora tenuifolia). Vingt-cinq souches de C. neoformans et 317 isolats Candida dont 113 C. albicans ont été isolés respectivement de 171 et 402 PVVIH à l'Hôpital Central de Yaoundé. Ces isolats ont été identifiés sur la base de leurs caractères phénotypiques, biochimiques, par spectrométrie de masse et par PCR quantitative. La diversité génétique de 150 isolats (25 prélèvement initiaux et 125 colonies) de C. neoformans a été réalisée par séro-génotypage, PCR-RFLP et polymorphisme de séquences microsatellites. La diversité génétique des 113 isolats de C. albicans a été réalisée par génotypage et par analyse du polymorphisme de séquences microsatellites. La recherche des espèces du complexe C. albicans s'est effectuée par amplification du gène Hwp1. La sensibilité des isolats de C. neoformans aux antifongiques (posaconazole, voriconazole, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, amphotéricine B et 5-fluorocytosine) a été évaluée par microdilution en milieu liquide grâce au kit « Sensititre YeastOne® ». Le protocole CLSI M27-A3 été utilisé pour l'étude de la sensibilité des isolats de C. albicans à l'amphotéricine B, au fluconazole, au ketoconazole et à l'itraconazole. L'étude de l'activité antifongique des extraits de plantes s'est déroulée en 3 étapes : (i) screening préliminaire avec détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits bruts, (ii) fractionnement bio-guidé, (iii) étude des interactions synergiques dans les combinaisons de ces subfractions. C. neoformans var grubii est la seule espèce de cryptocoque isolée des liquides céphalorachidiens. Quinze espèces de Candida ont été isolées et C. albicans reste l'espèce majoritaire. C. africana a été isolée et identifiée pour la première fois au Cameroun. La diversité génétique des isolats de C. neoformans a montré 14 types moléculaires, et 24% de patients étaient infectés par deux types moléculaires différents. Le génotype A est majoritaire dans les isolats de C. albicans et 65 types moléculaires différents ont été observés. L'analyse du polymorphisme du gène Hwp1 a permis de définir de nouveaux génotypes (H1-H6). Les souches de C. neoformans sont sensibles aux antifongiques testés. Une souche présente une sensibilité réduite à la 5-fluorocytosine et une autre au fluconazole. Des isolats issus du même patient peuvent présenter des sensibilités différentes aux antifongiques testés. Les isolats de C. albicans présentent une sensibilité aux antifongiques similaire à celle décrite dans la littérature. Il a été montré qu'il existe une relation entre la sensibilité à l'itraconazole et le génotype H chez les isolats de C. albicans (p-value <0,05). Les extraits de plantes présentent des activités inhibitrices contre les levures testées. Les fractions obtenues par fractionnement bio-guidé ont permis l'amélioration de l'activité de 7 extraits. La combinaison de ces subfractions a donné une combinaison synergique et fongicide dérivée de T. mantaly et de M. tenuifolia. En conclusion, ce travail apporte de nouvelles données sur la compréhension de l'épidémiologie moléculaire et de la sensibilité des isolats de C. neoformans et de Candida aux antifongiques à Yaoundé. L'étude des extraits de plantes semble être une voie prometteuse dans le développement de thérapies antifongiques alternatives.Cryptococcus neoformans and Candida species are the main causative agents of yeast opportunistic infections among HIV infected persons. However, information on molecular their epidemiology and antifungal susceptibility are scarce in Cameroon. The main objective of this work was to study the genetic diversity and the antifungal susceptibility against antifungal drugs and plant extracts of C. neoformans and Candida isolates from Yaoundé HIV patients. C. neoformans (25) and Candida (317 among which 113 C. albicans) Isolates were obtained, from 171 and 402 HIV patients at the Yaoundé Central Hospital respectively. They were identified by phenotypic and biochemical characters, by mass spectrometry and quantitative PCR. The genetic diversity of 150 C. neoformans isolates (25 initial isolates and 125 colonies) was carried out by serotyping, microsatellite length polymorphism and PCR-RFLP. The genetic diversity of the 113 C. albicans isolates was performed by genotyping and microsatellite length polymorphism. The identification of C. albicans complex species was achieved by PCR amplification of the Hwp1 gene. The antifungal susceptibility testing of C. neoformans against posaconazole, voriconazole, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, amphotericin B and 5-fluorocytosine was carried out by the broth microdilution test using the « Sensititre YeastOne® » kit. The CLSI M27-A3 protocol was used for the determination of the C. albicans isolate's susceptibility against amphotericin B, ketoconazole, fluconazole and itraconazole which are frequently used in Cameroon. The antifungal activity of extracts from Terminalia mantaly, Terminalia catappa and Monodora tenuifolia was performed by a preliminary screening with the determination of minimal inhibitory concentrations (MIC) of crude extracts. Selected extracts were therefore submitted to the bio-guided fractionation. Selected subfractions were submitted to combination assays. C. neoformans var grubii was the lonely Cryptococcus species isolated in cerebrospinal fluids. Fifteen Candida species were isolates from mucosae with C. albicans remaining the most frequent. C. africana has been isolated for the first time in Cameroon. C. neoformans and C. albicans provided 14 and 65 major molecular types respectively. It was also found that a patient can be infected by 2 different molecular types of C. neoformans. C. albicans genotype A was the most frequent. The PCR amplification of the Hwp1 gene allowed the identification of a novel molecular profile among the C. albicans complex and named H (H1-H6). C. neoformans isolates were susceptible to the tested drugs. However, one isolate exhibited reduced susceptibility to fluconazole and one another to 5-fluorocytosine. C. albicans isolates expressed various susceptibility profiles similar to what described in the literature. Furthermore, there was a relationship between the H-typing and the antifungal susceptibility of C. albicans isolates against itraconazole (p-value<0.05). T. mantaly, T. catappa and M. tenuifolia extracts exhibited antifungal activity against tested yeasts. Bioguided fractionation allowed improves of the antifungal activity from crude extracts to subfractions. Synergism was observed, and the most active combination from T. mantaly and M. tenuifolia was also fungicidal on tested yeasts. Conclusively, the present work brings new tools for the comprehension and the better management of C. neoformans and Candida infections among Yaoundé HIV positive patients. The antifungal resistance emergence of yeasts isolates could be compensated by the development of a new antifungal medicine from subfractions combinations of T. mantaly and M. tenuifolia