Towards the identification of molecular mechanisms involved in proanthocyanidin galloylation in grapevine

Abstract

Parmi les métabolites secondaires impliqués dans la qualité du raisin et du vin, les tanins condensés ou proanthocyanidines (PAs) jouent un rôle majeur, en particulier dans l'astringence et la stabilité de la couleur du vin. Ces molécules sont également impliquées dans la défense des plantes contre des stress biotiques et abiotiques. En outre, les effets bénéfiques des PAs pour la santé humaine sont bien documentés. Les PAs de la vigne ont la particularité d’être estérifiées avec de l’acide gallique. Une réaction d’acylation appelée galloylation est responsable de cette modification. Les études montrent que la galloylation influence les propriétés œnologiques et pharmacologiques des PAs. Dans la baie de raisin, les PAs sont synthétisés dans les premiers stades de développement, principalement dans les pellicules et les pépins. Un nombre relativement faible d'étapes enzymatiques sont nécessaires pour la biosynthèse de la structure de base de ces métabolites et les gènes correspondants sont aujourd'hui largement connus chez les plantes modèles, y compris chez la vigne. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans les étapes finales, y compris la galloylation, ne sont encore que partiellement connus. Des résultats antérieurs obtenus après la recherche de QTL influençant la composition du raisin, et en particulier le taux de galloylation des PAs, et des études transcriptomiques après surexpression de facteurs de transcription régulant la biosynthèse de la voie des PAs, ont permis l'identification de gènes potentiellement impliqués dans ces étapes. Des gènes de shikimate déshydrogénase (SDH) ont été identifiés. Ces gènes interviendraient en amont, pour la biosynthèse de l'acide gallique. Trois glucosyltransférases ainsi identifiées et déjà caractérisées au laboratoire sont impliquées dans la biosynthèse de l'ester de glucose de l'acide gallique (β-glucogalline), qui servirait d'intermédiaire pour la galloylation des PAs. Ces méthodes de criblage ont également permis d’identifier 2 acyltransférases de type sérine carboxypeptidase, nommées glucose acyltransférases (GATs) qui seraient capables de catalyser la dernière étape de galloylation: le transfert de l'acide gallique depuis la β-glucogalline sur les PAs. Le premier objectif de cette thèse a été de déterminer la fonction des SDHs codées par les gènes de vigne. Certaines SDHs recombinantes produites de façon hétérologue chez E.coli ont la capacité à produire de l'acide gallique in vitro. Leur niveau d’expression au cours du développement et dans différents tissus de la baie a également été établi. Les résultats obtenus in vitro sont étayés par le profil métabolique (acide gallique, β-glucogalline et PAs) de hairy-roots de vigne transformées avec un gène de SDH. Le second objectif de cette thèse a été de valider la fonction des GATs par expression transitoire dans des feuilles de tabac et des tests enzymatiques in vitro. La transformation transitoire de feuilles de vigne avec les GATs a permis de moduler la concentration d’esters phénoliques et nomment des flavan-3-ols galloylés in planta. L’étude de ces gènes a été étendue aux plantes vasculaires par des analyses phylogénétiques et a permis d’identifier des motifs peptidiques potentiellement impliqués dans les mécanismes étudiés et reflétant la sub-fonctionnalisation de certains gènes. Ce travail a fourni des informations sur les bases génétiques et les mécanismes moléculaires impliqués dans la biosynthèse de l'acide gallique et son transfert en deux étapes sur les flavan-3-ols (galloylation). De nouvelles hypothèses sur l'intervention de différents transporteurs et la nature des molécules transportées pourront être formulées.Among the secondary metabolites involved in grape berry and wine quality, condensed tannins or proanthocyanidins (PAs) play a major role, especially in astringency and color stability of wine. These molecules are also involved in plant defence against biotic and abiotic stresses. Furthermore, the beneficial effects of PAs to human health are well documented. In grapevine, PAs have the distinctive feature of being esterified with gallic acid. An acylation reaction called galloylation is responsible for this modification. Studies show that the galloylation influences oenological and pharmacological properties of PAs. In the grape berry, PAs are synthesized in the early stages of development, mainly in skin and seeds. A relatively small number of enzymatic steps are required for the biosynthesis of the basic structure of these metabolites and the corresponding genes are now widely known in model plants, including in grapevine. However, the molecular mechanisms involved in the final steps, including galloylation, are only partially known. Earlier results obtained after the search of QTL influencing the composition of the grape berry, especially the galloylation ratio of PAs, and transcriptomic studies after overexpression of transcription factors that regulate PAs biosynthesis pathway, have allowed the identification of genes potentially involved in these steps. Shikimate dehydrogenase (SDH) genes were identified. These genes would intervene upstream, for the biosynthesis of gallic acid. Three identified glucosyltransferases, already characterized in the laboratory, are involved in the biosynthesis of glucose ester of gallic acid (β-glucogalline), which could serve as an intermediary for PAs galloylation. These screening methods have also helped to identify 2 serine carboxypeptidase-like acyltransferases, called glucose acyltransferases (GATs) which are capable of catalyzing the last step of galloylation: the transfer of gallic acid from β-glucogalline to PAs. The first objective of this thesis was to determine the function of the SDHs encoded by grapevine genes. Recombinant SDHs, produced heterologously in E. coli, have the capacity to generate gallic acid in vitro. Their level of expression during development and in different tissues of the berry was also established. In vitro results are supported by the metabolic profile (gallic acid, β-glucogallin and PAs) of grapevine hairy -roots transformed with a SDH gene. The second objective of this thesis was to validate the function of the GATs by transient expression in tobacco leaves and in vitro enzyme assays. The transient transformation of grapevine leaves with GATs allowed to modulate the concentration of phenolic esters and notably galloylated flavan-3-ols in planta. The study of these genes was extended to vascular plants by phylogenetic analyses which allowed to identify peptide motifs potentially involved in the studied mechanisms and reflecting the sub-functionalization of certain genes. This work has provided informations on the genetic basis and molecular mechanisms involved in the biosynthesis of gallic acid and its two-step transfer on flavan-3-ols (galloylation). New hypotheses on the intervention of different carriers and nature of transported molecules can be proposed