New approaches for microorganisms detection combining proteomics, immuno-enrichment and bioinformatics

Abstract

Identifier rapidement des microorganismes pathogènes dans des échantillons environnementaux est un enjeu majeur dans le domaine de la biodéfense. Dans ce contexte, la spectrométrie de masse MALDI-TOF peut offrir une réponse simple, rapide et peu coûteuse. L'enjeu de la thèse, dans le cadre du projet ANR franco-allemand GEFREASE, a été de développer des méthodes permettant l'identification des microorganismes pathogènes et notamment de mettre en place des approches ciblées pour la préparation d'échantillon à l'aide d'anticorps en amont de la spectrométrie de masse. Dans un premier temps, l'étude du protéome de la bactérie modèle, Francisella tularensis subsp. holarctica LVS, responsable de la tularémie, a permis d'identifier les protéines et les peptides les plus abondants donnant un signal intense par spectrométrie de masse. Ensuite l'étude protéogénomique de douze protéines cibles a permis de choisir trois biomarqueurs dont le profil des masses par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (approche top-down) est spécifique de l'espèce et de la sous-espèce des bactéries du genre Francisella. Par cette méthode la virulence d'une souche est donc rapidement déterminée puisqu'elle est dépendante de la sous-espèce à laquelle la bactérie appartient. Ce test mis au point présente l'avantage d'être simple et rapide. Dans un deuxième temps, la mise au point d'un protocole d'enrichissement de la bactérie modèle par immunocapture magnétique a permis de montrer qu'il est possible de concentrer des bactéries grâce à des billes magnétiques couplées à des anticorps dirigés contre la bactérie entière. Cette approche a été expérimentée dans le cas de mélanges de bactéries où la bactérie modèle était largement minoritaire et dans des échantillons de matrices alimentaires diverses telles que de l'eau minérale ou du lait. La méthodologie a été validée sur un agent de classe 3, Francisella tularensis subsp. tularensis.The rapid identification of pathogenic microorganisms in environmental samples is a major issue in the biodefense field. MALDI-TOF mass spectrometry can offer a fast, straightforward and inexpensive answer. In the framework of the Franco-German ANR project GEFREASE, the purpose of the thesis was to develop methodologies allowing identification of pathogenic microorganisms and particularly to set up targeted approaches using antibodies for sample preparation beforehand mass spectrometry. First of all, the proteome study of Francisella tularensis subsp. holarctica LVS, responsible for tularemia, allowed us to identify the most abundant proteins and peptides, and for which the most intense signals are observed when using mass spectrometry. The proteogenomic study of twelve of these proteins enable us to choose three biomarkers for which the masses monitored by MALDI-TOF mass spectrometry (top down approach) allow deciphering the Francisella species and subspecies. The interest of this work is being able to conclude on a strain virulence based on the knowledge of the subspecies it belongs. The finalized test is easy and fast. Secondly, the development of a magnetic immunocapture of Francisella tularensis subsp. holarctica LVS allowed us to show that it is possible to concentrate bacteria using magnetic beads coupled to antibodies raised against the entire bacterium. This approach has been experimented in the case of bacterial mixtures where the model bacterium was largely in minority and for samples containing various food matrices such as mineral water or milk. The methodology has been validated on a class 3 agent, Francisella tularensis subsp. tularensis