The crystallographic study of the catalytic core domain of the avian rous associated virus type 1 (rav-1) integrase reveals a novel dimeric assembly

Abstract

Au cours du cycle réplicatif des rétrovirus, l’ADN viral rétro-transcrit est intégré dans l’ADN de la cellule hôte par l’intégrase virale (IN). L’IN possède un rôle clé dans le cycle rétroviral et représente une cible thérapeutique majeure pour le traitement des infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). L’IN est constituée de trois domaines (N-terminal, central et C-terminal) connectés par des boucles flexibles, qui la rendent difficilement cristallisable. Le Dr. C. Ronfort (Equipe Rétrovirus et Intégration Rétrovirale) et le Pr. P. Gouet (Laboratoire de BioCristallographie) collaborent depuis 2002 sur l’IN du Rous Associated Virus type 1 (RAV-1). Mes travaux de thèse s’inscrivent dans le cadre de cette collaboration. Il s’agissait de mener une étude cristallographique et moléculaire du domaine central de l’IN du RAV-1 pour pouvoir, ensuite, modéliser des mutants d’intérêt identifiés par l’équipe du Dr. C. Ronfort. Pour ce faire, le fragment protéique a été surproduit et purifié. Sa structure cristallographique a été résolue à une résolution de 1,8 Å. L’examen de cette structure révèle que le dimère de l’IN du RAV-1 peut s’assembler suivant une nouvelle interface moléculaire stabilisée par trois paires d’hélices α. Cet assemblage se caractérise également par la présence d’un étroit sillon basique à sa surface. Par des expériences in vitro de biochimie et in silico de docking, nous avons montré que ce sillon était susceptible de fixer un brin d’ARN. D’autre part, nos données expérimentales permettent d’expliquer comment les conditions de cristallisation, ainsi que la substitution d’un acide aminé de surface, favorisent la formation soit de ce nouvel arrangement dimérique, soit de l’arrangement dimérique classique. Ainsi, l’ensemble des données obtenues au cours de cette thèse suggère que l’intégrase possède des propriétés structurales modulables, lui permettant d’intervenir dans plusieurs étapes du cycle rétroviral en présence d’ADNdb (intégration) ou d’ARNsb (rétro-transcription et/ou encapsidation du génome ARN viral)During the replicative cycle of retroviruses, the retrotranscribed viral DNA is integrated into the host chromosome by the viral integrase protein (IN). The integration reaction is essential for the viral life cycle. Therefore, IN is a key target for antiretroviral drug design to treat HIV infection. IN consists of three domains (N-terminal, central and Cterminal) connected by flexible loops, making the enzyme difficult to crystallize. Dr C. Ronfort (Team Retrovirus and Retroviral Integration) and Pr P. Gouet (BioCrystallography Laboratory) collaborate since 2002 in Lyon to study IN from the Rous Associated Virus type 1 (RAV-1). My thesis work lies within this collaboration. Its objective was to perform crystallographic and molecular studies of the central domain of RAV-1 IN and of mutants of interest identified by the team of Dr C. Ronfort. In this aim, the IN fragment has been overexpressed and purified. Its crystal structure has been solved to a resolution of 1.8 Å. The observation of this structure reveals that the RAV-1 IN can exhibit a novel dimeric arrangement with a molecular interface stabilized by three pairs of facing α-helices. This arrangement is also characterized by the presence of a basic narrow groove at its surface. Thanks to biochemical in vitro experiments and in silico docking studies, we have shown that this median groove could allow the binding of a linear singlestranded RNA. Moreover, our experimental data can explain how the crystallization conditions as well as the mutation of a specific residue located at the surface of the enzyme favor either this novel dimeric arrangement or the classical dimeric interface. Therefore, the data obtained during this thesis suggest that IN exhibits modular structural properties, allowing it to operate in several distinct steps of the retroviral cycle in presence of dsDNA (integration) or ssRNA (reverse transcription and/or encapsidation of the retroviral RNA genome