Contribution to the study of the cycle of human corneal endothelial cell

Abstract

Les cellules endothéliales (CE), monocouche de cellules hexagonales jointives situées à la face interne de la cornée, assurent la transparence de ce tissu essentiel à la vision. Peu avant la naissance, ces CE perdent leur capacité proliférative en restant bloquées en phase G1du cycle cellulaire. Le non remplacement des cellules mortes est responsable de certaines pathologies cécitantes dont la cornea gutatta et les dystrophies bulleuses du pseudophaque sont les prototypes et comptent parmi les premières indications de greffe de cornée. Les mécanismes moléculaires impliqués dans l’arrêt de la prolifération de ces CE restent très partiellement expliqués. La première partie de cette thèse a pour objectif d’identifier si des changements d’expression transcriptionnelle des gènes régulateurs du cycle cellulaire interviennent au cours de l’organoculture (OC) et de la culture in vitro, afin de définir au mieux les cibles potentielles à inhiber ou celles à surexprimer pour re-déclencher une prolifération cellulaire contrôlée. Pour la première fois, nous avons mis en évidence des profils transcriptionnels variables en fonction de l’environnement des CE, avec une activation globale de l’expression des gènes en OC de routine et en culture primaire et l’expression accrue de gènes impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire en différents points comme DIRAS3, GADD45A, p15 p16, p18 et p19 ou impliqués dans la régulation du cycle des CE comme le complexe ubiquitine/protéasome (culines, APC...), laissant supposer que les freins antiprolifératifs sont encore plus complexes. Dans la seconde partie, nous avons développé une méthode d’analyse de la viabilité de l’endothélium pan-cornéenne afin d’évaluer au mieux la viabilité des cellules endothéliales sur les greffons. Nous avons développé un outil innovant de mesure combinant un triple marquage Hoechst/Ethidium/Calcéine AM à l’analyse pan-endothéliale permettant d’évaluer de définir la notion originale de densité en cellules viables d’une cornée. Cette technique peut être appliquée à l’analyse de n’importe quel procédé chirurgical ou non, susceptible d’altérer directement ou indirectement l’endothélium cornéenCorneal endothelial cells (EC) form a monolayer of hexagonal contiguous cells located at the inner surface of the corne and are responsible for maintenance of its transparency, and therefore essential for vision. Just before birth, they lose the proliferative capacity and remain blocked in the G1 phase of the cell cycle. The absence of cell replacement by mitosis induces is responsible for certain blinding diseases such as cornea gutatta and pseudophakic bullous keratopathy, two prototype endothelial diseases that are among the first indications of corneal graft. The molecular mechanisms involved is the non-proliferation of EC remain only partially explained. The first part of this thesis aimed to identify whether changes in transcriptional expression of cell cycle regulators genes occurred during organ culture (OC) and during in vitro culture, in order to better define the potential targets to inhibit or to overexpress necessary to trigger a controlled cell proliferation. Forthe first time we have highlighted variable transcriptional profiles depending on endothelial environment, with a glolal activation of gene expression in routine OC and in primary cultures, especially with an increased expression of gene involved in cell cycle arrest at different points like DIRAS3, GADD45, p15 p16, p18 and p19 or involved in cycle regulation as the ubiquitin/proteasome complex (Culines, APC ...), suggesting that the antiproliferative brakes are even more complex than previously reported. In a second part we developed an original method of pan-corneal endothelial viability assessment. This innovative measurement tool combines a triple Hoechst/Ethidium/Calcein-AM labeling with a part endothelial image analysis allowing to define the new concept of viable endothelial cell density, that represent the reaviable cell pool of a cornea. This technique can be applied to the analysis of any procedure (surgical or not), likely to directly or indirectly alter the corneal endotheliu