The Effect of Secretory 24p3 Protein on Endometrial Carcinoma Cell Line

Abstract

在哺乳動物系統中，疏水性結合蛋白的生物功能與作用尚未完全清楚，由於小白鼠24p3蛋白與人類NGAL胺基酸序列、蛋白質結構相似性高，被認為是不同物種的相似性蛋白，為瞭解本實驗室由小白鼠子宮液純化所得之子宮分泌性24p3蛋白在生殖系統的功能，因此我們利用人類子宮內膜癌細胞株RL95-2作為體外 (In vitro) 實驗時的標的細胞研究24p3蛋白的生理功能。以0.75The biological functions and reaction pathways of lipocalins in mammalian system were sought. Mouse uterine 24p3 protein is a secreted lipocalin from mouse uterus and it was human NGAL homologus protein. To evaluate the effect of uterine 24p3 protein on the reproductive system, human endometrial carcinoma cell line (RL95-2) was an experimental target for achieving the in vitro study. The cells were treated with 0.75口試委員會審定書 I 謝辭 II 中文摘要 III ABSTRACT IV 縮寫表 6 第一章 緒論 9 一、 疏水性分子結合蛋白家族 (LIPOCALIN SUPERFAMILY) 9 二、 24P3蛋白 --- 源起 9 三、24P3蛋白 --- 急性反應蛋白 11 四、子宮動情週期與生殖系統 12 五、24P3蛋白與子宮動情週期 14 六、子宮內膜週期性變化與細胞凋亡 15 七、24P3蛋白與細胞凋亡 16 八、細胞內活性氧與細胞凋亡 18 九、本研究目的與方向 19 第二章 實驗材料與方法 21 一、材料 21 二、藥品、試劑組 21 三、儀器 23 四、實驗方法 24 1. 人類子宮內膜癌細胞株(ATCC CRL1671, RL95-2 )細胞培養 24 2. 小白鼠子宮液中24p3蛋白質純化 25 3. 蛋白質定量 -- BCA (Bicinchoninic acid Protein Assay) 28 4. 24p3蛋白標記 29 5. 24p3蛋白與RL95-2細胞株之結合 30 6. 24p3蛋白的內吞作用 (Endocytosis) 30 7. 十二酯硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳 (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 31 8. 蛋白質染色 -- Coomassie BlueG250染色 33 9. RL95-2細胞總體蛋白萃取 (Total Protein Extraction) 33 10. 細胞總體核糖核酸 (Total RNA) 分析 34 11. 即時定量聚合酶連鎖反應 (Quantitative Real Time PCR) 37 12. Propidium iodide - Annexin V染色法判別細胞死亡 38 13. Caspase活性偵測 (PhiPhiLux/ CaspaLux kit) 39 14. 西方墨點法 (Western blot) 39 15. 細胞粒線體膜電位 (Mitochondrial membrane potential) 變化之偵測 40 16. 粒線體膜細胞色素c的釋放 42 17. 三明治免疫色法染細胞激素陣列膜 43 18. 錐蟲藍 (Trypan Blue) 染色法 43 19. 細胞內活性氧 (intracellular reactive oxygen species，ROS) 測定 43 20. NF