Novello, Elisa Eleonora Greco

Orientadora : Profa. Dra. Maria Berenice Reynaud SteffensCo-orientadora : Profa. Dra. Rose Adele MonteiroDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2012Bibliografia: fls. 96-110ResumoResumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio, Gram negativa, da classe ? das proteobactérias que pode ser encontrada colonizando endofiticamente milho, sorgo, cana de açúcar e arroz. No cluster nif de seu genoma foram encontrados os genes Hsero_2872 e Hsero_2855, cujos produtos foram anotados como proteínas da superfamília das globinas. O gene Hsero_2872 possui 642 pb e codifica para uma proteína de 213 aminoácidos. Ele se encontra a montante do gene nifA e é transcrito em sentido contrário a este. Na análise in silico de sua região promotora foram encontrados prováveis sítios de ligação para as proteínas NifA, FNR e um provável promotor dependente de sigma 54. A análise in silico da proteína codificada pelo gene Hsero_2872 mostrou homologia com uma globina, provavelmente, da família das hemoglobinas truncadas, porém análises estruturais e funcionais mais aprofundadas são necessárias para confirmar esta classificação. Ensaios realizados com a fusão da região promotora do gene Hsero_2872 com o gene repórter lacZ confirmaram sua funcionalidade que é dependente dos níveis de amônio no meio. A atividade do promotor em estirpes mutantes de H. seropedicae NifA-, FNR- e NtrC- foi menor do que na estirpe selvagem sugerindo a importância destas proteínas na expressão do gene Hsero_2872. Um mutante Hsero_2872 cromossomal foi obtido pela deleção de aproximadamente 230 pb da região central. Este mutante quando crescido em meios com diferentes concentrações de cloreto de amônio ou em presença de nitrito de potássio 1mM não apresentou diferenças no perfil de crescimento em relação ao observado para a estirpe selvagem. A atividade de nitrogenase do mutante foi aproximadamente metade da atividade da estirpe selvagem, o que pode sugerir um efeito da proteína Hsero_2872 no metabolismo do nitrogênio. Testes realizados com promotores dos genes nifA e nifB apresentaram menor atividade na estirpe mutante, sugerindo um papel importante da proteína para a atividade da proteína NifA.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a nitrogen-fixing bacterium, Gram-negative, ?-proteobacterium class, which can be found endophytically colonizing corn, sorghum, sugar cane and rice. Two genes were found on its nif cluster whose products were classified as proteins from the superfamily of globins, Hsero_2872 and Hsero_2855. The gene Hsero_2872 has 642 bp and encodes a 213 amino-acids protein. It is located upstream of the nifA gene and transcribed in the opposite direction to this. On the analysis in silico of the promoting region were found probable binding sites for the proteins NifA, FNR and a sigma 54 dependent promoter. In silico analysis of the protein encoded by the Hsero_2872 gene showed to be a globin, probably from the family of truncated hemoglobin, but deeper structural and functional analysis are required to confirm this classification. Analysis performed with the lacZ fusion of the promoter region of Hsero_2872 gene confirmed its functionality and dependence on ammonium levels on the media. The promoter activity on mutant strains of H. seropedicae NifA-, FNR- e NtrC- was lower than on wild type strain suggesting the importance of those proteins in the expression of the Hsero_2872 gene. A mutant Hsero_2872 chromosomal was built with deletion of approximately 200 bp of the central region. This mutant when grown in media with different concentrations of ammonium chloride or in the presence of 1mM potassium nitrite showed no differences in growth profile relative to that observed for a wild type strain. The nitrogenase activity of the mutant Hsero_2872 was approximately half the activity of the wild type strain, which may suggest an effect of Hsero_2872 protein on nitrogen metabolism. Tests with promoters and genes nifA and nifB showed less activity in the mutant strain Hsero_2872, suggesting an important role of the protein for the best activity of NifA protein

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Caracterização funcional de uma globina putativa codificada pelo Gene Hsero_2872 de Herbaspirillum seropedicae SMR1

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