Orientadora: Profa. Dra. Jaísa Fernandes SoaresCoorientadora: Profa. Dra. Giovana Gioppo NunesDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Química. Defesa : Curitiba, 31/03/2017Inclui referências: p. 124-140Resumo: O decavanadato, [HnV10O28] n-6 ou "V10", é um potente inibidor enzimático cujo papel tem sido avaliado em diferentes aplicações medicinais. Neste trabalho buscouse sintetizar o V10 com quatro contraíons orgânicos que são endógenos ou amplamente utilizados em ensaios biológicos: os ácidos conjugados da nicotinamida e da isonicotinamida, do 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol ("tris") e da piridoxina, e avaliar a ação dos produtos sobre culturas de bactérias (Escherichia coli). A reação do V2O5 com isonicotinamida ou nicotinamida (2,5:3) gerou cristais amarelos de (1,3-C6H7N2O)4[H2V10O28]·2H2O·2C6H6N2O (NicoV10) e de (1,4-C6H7N2O)4[H2V10O28]·2C6H6N2O (IsoV10) em alto grau de pureza. Estes produtos foram caracterizados por difratometria de raios X de monocristal, análise elementar, análise termogravimétrica e por métodos espectroscópicos, como RMN de 1H e 51V, espectroscopia vibracional (IV e Raman), RPE e espectroscopia eletrônica (UV-vis). Os espectros de RMN de 51V em D2O apresentaram sinais em = -425 ppm, -507 ppm e -525 ppm, referentes aos três ambientes de coordenação do vanádio na estrutura do polioxoânion [H3V10O28] 3- , indicando a manutenção da estrutura polinuclear em solução. A reação de NaVO3 com tris, por sua vez, produziu o decavanadato [(HOCH2)3CNH3]4[H2V10O28]·10H2O (TrisV10), enquanto a reação com piridoxina levou à formação do complexo binuclear [(VO2)2µ2-(C8H10NO3)2] (PirV2). Estes dois sistemas mostraram-se complexos devido à ocorrência de reações redox envolvendo os centros metálicos e à cristalização conjunta com decavanadatos contendo contraíons inorgânicos. O efeito inibitório de IsoV10 e NicoV10 sobre o crescimento de células procarióticas foi avaliado em culturas de E. coli. Os valores de GI50 de 2,8 mmol L -1 para NicoV10 e de 4,0 mmol L -1 para IsoV10 foram significativamente menores do que o determinado para o decavanadato de sódio, [{Na6(H2O)20V10O28·4H2O}n] - NaV10 (GI50 de 11,0 mmol L -1 ). A toxicidade do decavanadato frente a células procarióticas foi avaliada também pelo emprego da técnica de citometria de fluxo. Para tal, determinou-se o efeito dos compostos de interesse sobre o potencial de membrana, a permeabilidade da membrana celular e a produção de espécies reativas de oxigênio pelas culturas bacterianas tratadas com NaV10, IsoV10 e NicoV10. A medida da ação sobre o potencial de membrana produziu resultados similares para as culturas tratadas com os três compostos (NaV10, IsoV10 e NicoV10), e a diminuição deste potencial na presença dos polioxovanadatos foi cerca de quatro vezes maior em relação à cultura controle não tratada. A porcentagem de bactérias inviáveis foi de 32,3% para NaV10 e de 100% para IsoV10 e NicoV10, confirmando a potencialização da toxicidade do polioxovanadato pelas espécies orgânicas em solução. Também foram observadas diferenças significativas nos níveis de ERO gerados por IsoV10 e NicoV10 (aumento de 1,4 e 1,7 vezes, respectivamente) em relação ao valor obtido para NaV10. A combinação dos ensaios realizados por citometria de fluxo evidenciou o aumento do estresse oxidativo e a destruição da membrana celular, um componente vital para as células. A atividade citotóxica relativa dos polioxometalatos (NicoV10 > IsoV10 > NaV10) está possivelmente associada à estabilidade do agregado metálico em solução e depende das interações que são criadas entre o ânion e as bactérias na presença ou não das moléculas orgânicas. Palavras-chave: Decavanadato, cátions orgânicos, Escherichia coli, inibição do crescimento, citometria de fluxo.Abstract: Decavanadate, [HnV10O28]n-6 or "V10", is a potent enzyme inhibitor which hasbeen evaluated for diverse medicinal applications. The present work aimed at synthesizing V10 with four counterions that are endogenous or largely used in biological assays: the conjugate acids of nicotinamide, isonicotinamide, 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol ("tris"), and pyridoxine. The reaction of V2O5 with nicotinamide or isonicotinamide (2,5:3) yielded highly pure yellow crystals of (1,3-C6H7N2O)4[H2V10O28]·2H2O·2C6H6N2O (NicoV10) and (1,4-C6H7N2O)4[H2V10O28]·2C6H6N2O (IsoV10). The products were characterized by single-crystal X-ray diffraction, elemental and thermogravimetric analyses, together with spectroscopic methods such as 1H and 51V NMR, vibrational (FTIR and Raman), EPR and electronic (UV-Vis) spectroscopies. The 51V NMR spectra in D2O presentedsignals at ? = -425 ppm, -507 ppm and -525 ppm related to the three coordination environments of vanadium in the structure of the polyoxoanion [H3V10O28]3-, whichindicates that the polynuclear structure is maintained in solution. The reaction of NaVO3 with "tris" yielded the decavanadate [(HOCH2)3CNH3]4[H2V10O28]·10H2O (TrisV10), whereas the reaction with pyridoxine produced the binuclear complex [(VO2)2?2-(C8H10NO3)2] (PirV2) These systems have been shown to be complex due to the occurrence of redox reactions involving the metal centers, and to crystallization together with decavanadates containing inorganic counterions. The inhibitory effect of IsoV10 and NicoV10 upon growth of prokaryotic cells was evaluated in E. coli cultures. GI50 values of 2.8 mmol L-1 for NicoV10 and 4.0 mmol L-1 for IsoV10 weresignificantly lower than that determined for sodium decavanadate, [{Na6(H2O)20V10O28·4H2O}n] - NaV10 (GI50 of 11.0 mmol L-1). The toxic effect ofdecavanadate on prokaryotic cells was also evaluated by the flow cytometry technique. Parameters such as membrane potential, membrane permeability and the production of reactive oxygen species were analyzed on the bacterial cultures treated with NaV10, IsoV10 and NicoV10. The measured effect on the bacterial membrane potential was similar in the cultures treated with all three compounds (NaV10, IsoV10 and NicoV10), and the observed damage was about four times higher as compared to the non-treated control culture. The percentage of non-viable cells was 32.3% for NaV10 and 100% for IsoV10 and NicoV10, which confirms the enhancement in the toxic effect of the polyoxovanadate in the presence of its organic counterions in solution. Moreover, significant differences were found in the concentrations of reactive oxygen species produced by IsoV10 and NicoV10, which were respectively 1.4 and 1.7 times higher than the reference value obtained for NaV10. The combination of the results obtained by flow cytometry evidenced an increased level of reactive oxygen species and a complete damage to the membrane, an essential cell element. The relative cytotoxic activity of the polyoxometalates (NicoV10 > IsoV10 > NaV10) is possibly associated with the stability of the metal aggregates in solution, and depends on the interactions between the anion and the bacteria in the presence or absence of the organic molecules. Key words: Decavanadate, organic cations, Escherichia coli, growth inhibition, flow cytometry
