Im August 2018 sorgte eine in Science Translational Medicine publizierte Studie von Pidot et al. für ein erhebliches Medienecho. Die Autoren untersuchten die Alkoholtoleranz bei Enterokokken, insbesondere bei den klinisch sehr relevanten Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE). Begründen die dargestellten Ergebnisse tatsächlich eine reale Gefahr für die Wirksamkeit von Hände­desinfektions­mitteln? Diese Frage wird im Epidemiologischen Bulletin 38/2018 diskutiert.Peer Reviewe

Arvand, Mardjan

Brunke, Melanie

Konrat, Katharina

Schwebke, Ingeborg

Werner, Guido

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Ist die Wirksamkeit von alkoholischen Händedesinfektionsmitteln bei Enterokokken wirklich in Gefahr?

Publikationsserver des Robert Koch-Instituts

Epidemiologisches Bulletin20. September 2018 / Nr. 38 aktuelle daten und informationen zu infektionskrankheiten und public healthIst die Wirksamkeit von  alkoholischen Händedesinfek-tionsmitteln bei Enterokokken wirklich in Gefahr?Überregionale Häufung von Burkholderia-cepacia-complex-Nachweisen bei IntensivpatientenGeneralversammlung der  Vereinten Nationen: High Level Meeting zu TuberkuloseAusschreibung für die EPIET-  und EUPHEM-Kohorte 2019Aktuelle Statistik meldepflichtigerInfektionskrankheiten35. Woche 2018Diese Woche 38/2018 Ist die Wirksamkeit von alkoholischen Händedesinfektions-mitteln bei Enterokokken wirklich in Gefahr?Im August 2018 sorgte eine in Science Translational Medicine publizierte Stu-die von Pidot et al.1 für ein erhebliches Medienecho.2,3 Die Autoren untersuch-ten die Alkoholtoleranz bei Enterokokken, insbesondere bei den klinisch sehr relevanten Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE).1 Bei der Suche nach Ursachen für die hohe Prävalenz von VRE-Infektionen in Australien stellten sie die Hypothese auf, dass die Entwicklung alkoholtoleranterer Isolate durch die Einführung alkoholbasierter Händedesinfektionsmittel im Jahr 2002 und den damit verbundenen erhöhten Alkoholstress bedingt sei. Aus ihren Studien- ergebnissen leiteten sie ab, dass tolerantere VRE-Stämme die Sicherheit der Standardhändehygiene potenziell gefährdeten. Die Bewertung in den Me-dien und die daraus resultierende Verunsicherung auch in Fachkreisen ha-ben uns dazu veranlasst, die Untersuchungen von Pidot et al. bezüglich ihrer Relevanz für die Wirksamkeit von Händedesinfektionsmitteln gegen Entero-kokken zu diskutieren. Es stellt sich die Frage, ob die dargestellten Ergebnisse Lücken in den europäischen Wirksamkeitsnachweisen aufzeigen und tatsäch-lich eine reale Gefahr für die Wirksamkeit von Händedesinfektionsmitteln be-gründen können. Deshalb soll im Folgenden die Studie von Pidot et al. im Kon-text zu deutschen bzw. europäischen Wirksamkeitsnachweisen für Händedes- infektionsmittel erläutert werden.Wirksamkeitsnachweise für Händedesinfektionsmittel In Deutschland (und ähnlich auch in Europa) wird die Wirksamkeit von Des-infektionsmitteln mit validierten Suspensions- und praxisnahen Tests nachge-wiesen. Als Grundlage dienen die europäischen Normen sowie Prüfmethoden des Verbundes für Angewandte Hygiene (VAH). Im Suspensionsversuch wer-den definierte Stämme vorgeschriebener Spezies einbezogen, die in Tabelle 1 Europäische Prüfmethoden Untersuchungen von Pidot et al. 20181Suspensionsversuchgemäß DIN EN 137274 und DIN EN 136245bzw. VAH-Methode 96Testorganismen: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae, Escherichia coli K12, Candida albicansTestbedingungen: drei Konzentrationen, Ein-wirkzeit: 15, 30 und 60 sSuspensionsversuch nicht näher beschriebenTestorganismen: Enterococcus faecium (139 klini-sche Isolate) Testbedingungen: Konzentration 23 % und 70 % Isopropanol, Einwirkzeit: 5 minPraxisnaher Versuchgemäß DIN EN 15007 mit 21 Probanden und statistischer Auswertung (E. coli K12) bzw. VAH-Methode 116TierversuchTierversuch zur Infektion von Mäusen über kontaminierte und anschließend – desinfizierte Flächen (Isopropanol 70 %)GrundlagenforschungMolekularbiologische Untersuchung zu Genloci, denen eine mögliche Rolle in der Alkoholtoleranz zugeordnet wurde.Tab. 1: Übersicht über europäische Prüfmethoden und Gegenüberstellung mit den Untersuchungen von Pidot et al.416 Robert Koch-Institut Epidemiologisches Bulletin Nr. 38 20. September 2018 dargestellt sind. Nach dem Wirksamkeitsnachweis im Suspensionsversuch muss zusätzlich ein praxisnaher Test mit Probanden, deren Hände mit einem apathogenen E.-coli-Stamm kontaminiert wurden, durchgeführt werden. Ein Händedesinfektionsmittel gilt dann als wirksam, wenn es keine geringere Reduktion als das Referenzprodukt – 60 %iges Isopropanol, zweimal 30 Sekunden angewendet – erzielt.Untersuchungen der Gruppe um Pidot im Vergleich zu europäischen AnforderungenBasierend auf ihrer Hypothese wählten die Autoren unter-schiedliche Versuchsanordnungen von klassischer Mikro-biologie bis hin zu anspruchsvollen bioinformatischen und molekularbiologischen Untersuchungen. Sie untersuchten 139 Enterokokken-Isolate von Patienten aus zwei Kranken-häusern in Melbourne, die zwischen 1997 und 2015 gewon-nen wurden. Diese Isolate wurden drei definierten Zeiträu-men zugeordnet, für die jeweils eine unterschiedliche Zahl von Isolaten vorhanden war. a) SuspensionsversucheAls erstes führten Pidot et al. Suspensionstests nach ei-nem internen, nicht näher beschriebenen Protokoll durch. Die Ermittlung der Zahl der überlebenden Bakterien nach Alkoholeinwirkung erfolgte hierbei nach Methoden, die nicht den europäischen Normen entsprechen. Damit ist fraglich, ob das Desinfektionsmittel nach der Einwirkung ausreichend neutralisiert wurde 8, was als wesentliche An-forderung der europäischen Prüfmethoden gilt. Ungewöhn-lich hoch im Verhältnis zu europäischen Normen erscheint auch die Nachweisgrenze für überlebende Bakterien.Pidot et al. stellten mit diesen Tests fest, dass mit der üb-lichen Gebrauchskonzentration von 70 % Isopropanol alle Enterokokken-Isolate im Suspensionsversuch verlässlich abgetötet werden. Um Unterschiede zwischen den Isola-ten quantifizieren zu können, setzten die Verfasser eine Isopropanol-Konzentration von 23 % ein. Mit der Bestäti-gung der wirksamen Konzentration und der Abgrenzung des unwirksamen Bereiches im Suspensionsversuch wären die europäischen Norm-Anforderungen erfüllt. Eine weite-re Differenzierung im Grenzbereich der Wirksamkeit, wie von Pidot et al.1 vorgenommen, wäre von Interesse für die Grundlagenforschung, jedoch nicht von infektionshygieni-scher Relevanz.Grundsätzlich eignen sich Suspensionsversuche nach va-lidierten Methoden aufgrund der geringen Zahl von Ein-flussfaktoren gut, um Unterschiede in der Wirksamkeit festzustellen. Ihre Ergebnisse lassen jedoch meist keine praktische Anwendungsempfehlung zu, da Bedingungen wie in der homogenen Suspension in der Praxis, z. B. bei der Händedesinfektion, selten vorliegen. In ihren Suspen-sionsversuchen konnten die Autoren Unterschiede in der Alkoholtoleranz in einem Konzentrationsbereich zeigen, der weit unterhalb der üblichen Anwendungskonzentratio-nen liegt. Hieraus kann aber keine Aussage über die Wirk-samkeit der wesentlich höher konzentrierten alkoholischen Händedesinfektionsmittel in der Praxis abgeleitet werden. b) TiermodellZusätzlich zu den Suspensionsversuchen entwickelten die Autoren ein komplexes Tiermodell. Hier wurden mit Anti-biotika vorbehandelte Mäuse in Käfige gesetzt, die vorher jeweils mit unterschiedlich toleranten E.-faecium-Isolaten kontaminiert worden waren. Bevor die Mäuse in die Käfi-ge gesetzt wurden, wurden die Käfigoberflächen mit Fil-terpapierstückchen, die 70 %iges Isopropanol enthielten, gewischt. Die Zahl der im Anschluss kolonisierten Mäuse (Untersuchung der Faeces auf das jeweilige zur Konta-mination verwendete E.-faecium-Isolat) galt als indirektes Maß für die Fähigkeit der Isolate, die Wischdesinfektion zu überleben. Der hier beschriebene Flächentest wurde somit mit einem Tierversuch zur Kolonisationsfähigkeit der Iso-late verknüpft. Je komplexer ein Test gestaltet wird, desto schwieriger ist es, ein gefundenes Ergebnis einer einzelnen Ursache ein-deutig zuzuordnen. Der Einsatz von Tieren ist streng regu-liert und lässt nur eine geringe Stichprobengröße zu, was sich wiederum auf die statistische Aussagekraft auswirkt. Bei jeweils sechs Mäusen wurde eine erhöhte Kolonisie-rungsrate durch die toleranteren Isolate beobachtet. Pidot et al. diskutierten als mögliche Ursache die höhere Bestän-digkeit der Isolate gegen Isopropanol. Betrachtet man die Zahlen der Bakterien auf den Käfigflächen, unterschei-den sich die Zahlen der als “tolerant“ eingestuften Isolate (9 – 33  Koloniebildende Einheiten [KBE]/cm²) von den als „nicht tolerant“ eingestuften Isolaten (0 – 1 KBE/cm²) je-weils um nur eine Zehnerpotenz. Obwohl in den Käfigen mit den als „nicht tolerant“ eingestuften Isolaten zum Teil weniger als 1 KBE/cm² nachgewiesen wurde, wurde in den einzelnen Tests bei bis zu vier der insgesamt sechs Mäuse eine Kolonisierung beobachtet. Da selbst minimale Bak-terienzahlen der „nicht toleranten“ Isolate noch zu einer Kolonisierung führen, ist es fraglich, ob mit diesen gering-fügigen Unterschieden in der Zahl der überlebenden Bak-terien (nahe der Nachweisgrenze) und der kolonisierten Mäuse die Hypothese der Autoren gestützt werden kann. Weiterhin liegt das eingesetzte Isopropanol-Volumen, das zur Wischdesinfektion des Käfigbodens aufgebracht wur-de, deutlich unter dem im europäischen 4-Felder-Test9 vorgesehenen zu testenden Volumen. Werden wie hier an-gewendet nur sehr geringe Desinfektionsmittelvolumina aufgebracht, so ist nicht zu erwarten, dass alle Bakterien ausreichend in dem Mittel emulgiert und dadurch abgetö-tet werden. Dies gilt insbesondere bei flüchtigen Substan-zen wie Alkoholen. Diese Abhängigkeit der Wirksamkeit von der Menge des Desinfektionsmittels bei der Flächen- wie auch bei der Händedesinfektion wurde bereits in einer Vielzahl von Untersuchungen gezeigt.10,11,12 In Europa stehen zur Flächendesinfektion zwei in Ring-versuchen erprobte praxisnahe Tests zur Verfügung, die 20. September 2018  Epidemiologisches Bulletin Nr. 38 Robert Koch-Institut 417ohne Tierversuche erfolgen: EN 166159 und EN 1369713. Europäische Prüfmethoden müssen anwendungsbezogen eingesetzt werden, d. h. unterschiedliche Tests sind für Flä-chen– oder Händedesinfektionsmittel vorgesehen, da sich unbelebte Flächen von menschlicher Haut unterscheiden. Danach wäre es nicht zulässig mit einem Flächentest Aus-sagen zur Wirksamkeit von Händedesinfektionsmitteln zu machen. c) molekularbiologische und bioinformatische Untersu-chungenDie genetische Basis einer Toleranzentwicklung von Ente-rokokken wurde bioinformatisch und molekularbiologisch untersucht, konnte aber nicht abschließend aufgeklärt wer-den. Über einen aufwendigen bioinformatischen Vergleich von 129 E.-faecium-Isolaten, die ein ähnliches Kerngenom, aber unterschiedliche Toleranzeigenschaften aufwiesen, identifizierten die Autoren drei Loci, die möglicherweise eine Rolle in der Toleranz gegenüber alkoholischen Lösun-gen spielen könnten.Hierbei handelte es sich erstens um zwei Varianten einer Punktmutation in dem Gen für die RNA-Polymerase Un-tereinheit B (rpoB), zweitens um eine Punktmutation in ei-nem Galactosidsymporter-kodierenden Gen sowie drittens um eine Region, die regulatorische Elemente der Zellhülle kodiert.Ausgehend von diesen Genloci wurden in dem als beson-ders tolerant eingestuften Isolat E. faecium ST796 drei Mutanten hergestellt. Untersucht wurde eine der beiden Punktmutationen der RNA-Polymerase-Untereinheit und Deletionen größerer Bereiche der beiden anderen Genloci. Diese drei Mutanten zeigten in Wachstumsversuchen ein generell verringertes Wachstum bei 3 % (v/v) Isopropanol. Durch die ausgedehnten Deletionen können ggf. polare Effekte in der Transkription oder ein genereller Effekt auf die Integrität der Zellumhüllung und ein damit einherge-hender genereller Effekt auf die bakterielle Fitness nicht ausgeschlossen werden. Da die RNA-Polymerase im Zell-stoffwechsel eine zentrale Rolle einnimmt, kann auch hier eine Punktmutation bereits einen erheblichen Effekt auf den gesamten Metabolismus haben. Die Arbeitsgruppe schlussfolgerte, dass die einzelnen Genloci nicht für eine Toleranz gegenüber alkoholischen Lösungen verantwortlich sind, sondern dass dieses Phäno-men auf mehreren Faktoren beruhen muss.Der in diesen Untersuchungen eingesetzte besonders tolerante Stamm E. faecium ST796 wurde erstmals 2010 nachgewiesen und macht im letzten der von Pidot et al. untersuchten Zeiträume (2010 – 2015) 15 von insgesamt 70 untersuchten Isolaten aus. Ein anderer E.-faecium-Stamm, ST17, ist über den gesamten Untersuchungszeitraum nach-weisbar, wobei tolerantere und weniger tolerante Isolate in allen Zeitabschnitten zu finden sind. Die Signifikanz der Zunahme der Toleranz nach 2010 wäre infolge der unter-schiedlichen Zusammensetzung und Größe der Stichpro-ben fraglich. Unstrittig ist jedoch die weite Verbreitung des Stammes E. faecium ST796 in den beiden Krankenhäusern seit 2010. Interessanterweise wurde kürzlich über das Auf-treten eines genetisch nah verwandten Stammes in der Schweiz berichtet.14,15 Das Auftreten von neuen Epidemie-stämmen und Zurückdrängen von etablierten Varianten ist bei Infektionserregern ein lange bekanntes Phänomen. Ob die hier identifizierten genetischen Veränderungen über die Zeit zur erfolgreichen Verbreitung dieser neuen Stammvarianten beitragen bleibt zu weiten Teilen hypothe-tisch.FazitMit den unter a bis c beschriebenen komplexen Untersu-chungen (s. oben) versuchten die Autoren Hinweise dafür zu liefern, dass die Entwicklung von VRE mit erhöhter Alkoholtoleranz mit dem Einsatz alkoholischer Hände-desinfektionsmittel assoziiert sei. Die von den Autoren in Suspensionsversuchen ermittelten Ergebnisse zeigen, dass die 139 untersuchten Isolate aus zwei Krankenhäusern ei-ner Stadt bei geringen Isopropanol-Konzentrationen (d. h. weit unter Gebrauchskonzentrationen) Unterschiede in der Empfindlichkeit aufweisen. Derartige Varianzen in der Toleranz von Enterokokken gegenüber verschiedenen Wirkstoffen auch Alkoholen, sind spätestens seit den 90er Jahren bekannt.16 Ob es sich hier tatsächlich um eine lang-fristige und fortlaufende Änderung der Toleranz in ende-mischen Enterokokken-Stämmen handelt oder ob ein sehr virulenter Stamm ggf. auch eine höhere Toleranz besitzt, wird nicht schlüssig dargelegt. Der mit einem Tierversuch verbundene Flächentest eignet sich durch die beschriebe-nen Einflussfaktoren nicht als Beleg der Hypothese. Auch die molekularbiologischen Untersuchungen tragen zur Be-wertung der Ergebnisse nicht wesentlich bei.Die vorgelegten Ergebnisse geben keinen Anlass an der Wirksamkeit geprüfter Händedesinfektionsmittel bei kor-rekter Anwendung zu zweifeln. Unsere Einschätzung steht im Einklang mit der des Begründers der Kampagne der Weltgesundheitsorganisation „Saubere Hände“ (Clean your hands), Didier Pittet. Er zitiert die bereits 2016 ohne Peer Review-Verfahren auf einer Online-Plattform publizierte Version dieser Studie mit dem Hinweis: “However, it is easy to see how the media could misunderstand or mis-handle information like this to create alarmist headlines that could undermine belief in the effectiveness of ABHR (alcohol based handrub).”17 Die Vermittlung der Diskre-panz zwischen dem One-Sentence-Abstract und den tatsäch-lichen Inhalten der Studie ist hier von fundamentaler Be-deutung sowohl für die Händehygiene als Grundlage der öffentlichen Gesundheit und Infektionsprävention als auch für das Ansehen von wissenschaftlichen Veröffentlichun-gen als Informationsquelle.418 Robert Koch-Institut Epidemiologisches Bulletin Nr. 38 20. September 2018 Literatur: 1. Pidot SJ et al.: Increasing tolerance of hospital Enterococcus faecium to handwash alcohols. Transl. Med.; 10: eaar6115 (2018). 1. August 2018 2. 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Desinfektionsmittel-Kommission im VAH (Hrsg): Anforderungen und Methoden zur VAH-Zertifizierung chemischer Desinfektionsverfahren. Stand: 02.04.2015, Loseblattsammlung. mhp-Verlag, Wiesbaden 2015 7. DIN EN 1500:2013-07: Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika – Hygienische Händedesinfektion – Prüfverfahren und Anforderungen (Phase 2/Stufe 2); Deutsche Fassung EN 1500:2013  8. Peters J: Zum Einsatz des Spiral Platers bei der Prüfung von Desinfekti-onsmitteln auf Wirksamkeit gegen Mykobakterien. Hygiene & Medizin 1994; 18: 19 – 25 9. DIN EN 16615: Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika – Quan-titatives Prüfverfahren zur Bestimmung der bakteriziden und levurozi-den Wirkung auf nicht-porösen Oberflächen mit mechanischer Einwir-kung mit Hilfe von Tüchern im humanmedizinischen Bereich (4-Felder-Test) – Prüfverfahren und Anforderungen (Phase 2, Stufe 2); Deutsche Fassung EN 16615:2015 Ausgabe 2015-0610. Spicher G, Peters J: Abhängigkeit der mikrobiologischen Befunde der Wirksamkeitsprüfung von Flächendesinfektionsmitteln von den Prüfbe-dingungen. Hygiene & Medizin 1997; 22: 123 – 14011. Sickbert-Bennett EE1, Weber DJ, Gergen-Teague MF, Rutala WA: The ef-fects of test variables on the efficacy of hand hygiene agents. Am J Infect Control. 2004; 32(2):69 – 8312. Macinga DR1, Shumaker DJ, Werner HP, Edmonds SL, Leslie RA, Parker AE, Arbogas: The relative influences of product volume, delivery format and alcohol concentration on dry-time and efficacy of alcohol-based hand rubs. BMC Infect Dis. 2014 Sep 20; 14: 511. doi: 10.1186/1471-2334-14-511.13. DIN EN 13697: Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika – Quantitativer Oberflächen-Versuch nicht poröser Oberflächen zur Be-stimmung der bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung chemischer Desinfektionsmittel in den Bereichen Lebensmittel, Industrie, Haus-halt und öffentliche Einrichtungen – Prüfverfahren und Anforderungen ohne mechanische Behandlung (Phase  2, Stufe  2); Deutsche Fassung EN 13697:2015 Ausgabe 2015-0614. Wassilew Nasstasja, Seth-Smith Helena MB, Rolli Eveline, Fietze Yvonne, Casanova Carlo, Führer Urs, Egli Adrian, Marschall Jonas, Buetti Niccolò: Outbreak of vancomycin-resistant Enterococcus fae-cium clone ST796, Switzerland, December 2017 to April 2018. Euro Surveill. 2018;23(29):pii=1800351. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2018.23.29.180035115. Liechtensteiner Volksblatt (Autor nicht angegeben): Multiresisten-te in der Schweiz auf dem Vormarsch. Liechtensteiner Volksblatt 09.08.2018:2416. Bradley CR, Fraise AP: Heat and chemical resistance of enterococci. 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https://edoc.rki.de/bitstream/176904/5763/1/38_2018_DOI.pdf

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