The work presented in this thesis describes the development of a universal platform for the biochemical detection of protein post-translational modifications (PTM) using the quenching resonance energy transfer (QRET) technique in an antibody-free system. The QRET technique employed is based on the difference in the luminescence signal produced by the target bound and unbound to a Ln3+-ligand in the presence of soluble quenchers.
In the project, PTM monitoring was first demonstrated in a simple QRET tyrosine EGFR assay using antibodies to recognize the modified substrate peptide, a commonality in FRET assays, yet in a single-label approach. On the basis of this, a universal PTM detection method called “the peptide-break technology” was further developed as an antibody-free system. The approach relied on the peptide dimerization concept of leucine zipper (LZ) coiled-coils. The dimer was composed of an enzyme-substrate peptide and a detection Eu3+-peptide. In the assay, the PTM addition to the substrate peptide disrupted the dimer, leading to a low luminescence signal, whereas without PTM addition the dimer formation proceeds and provides Eu3+-chelate protection leading to a high luminescence. The peptide-break technology was successfully developed for a variety of enzymes for phosphorylation, dephosphorylation, deacetylation, and citrullination, using nanomolar concentrations without the need for antibodies or enzyme reporters.
Later, the peptide-break technology was simplified and optimized to increase the freedom for substrate peptide selection and design. The peptide dimerization was mediated by the interaction between oppositely charged peptides. Finally, the technology was further studied in a thermal shift assay, allowing the use of high substrate peptide concentrations that are needed in assays with low affinity or activity enzymes. The reported data suggest that this technology is potentially applicable to other challenging PTM types, possibly providing new assay solutions within academia as well as for the pharmaceutical industry.Peptide-break teknologia: Uusi lääkeseulontaan soveltuva menetelmä proteiinien jälkitranslationaalisten modifikaatioiden
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää universaali biokemiallinen ja ilman vasta-aineita toteutettu määritysalusta proteiinien jälkitranslaationaalisten modifikaatioiden (PTM) havainnointiin. PTM-reaktion havainnoinnissa käytettiin sammutus-resonanssi-energiansiirtoa (QRET), joka perustuu sammuttajamolekyylin kykyyn erotella kohteeseen sitoutunut ja sitoutumaton lantanidikelaatin sisältämä reportterimolekyyli ja luoda tähän perustuva luminesenssi-signaalin muutos.
Ensimmäisenä QRET teknologian soveltuvuus PTM havainnointiin osoitettiin käyttäen lyhyttä repotteripeptidiä ja leimaamatonta vasta-ainetta, joka tunnisti epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGFR) luoman fosfotyrosiinin. Universaalin määritysalustan luomiseksi, PTM havainnointiin kehitettiin vasta-aineista riippumaton ”peptide-break” teknologia, joka perustuu luontaisiin kahden peptidin muodostamiin leusiinivetoketju-rakenteisiin. Perustilassaan sitoutuneet muokkaamattomat peptidit tuottavat korkean luminesenssi-signaalin, mutta aktiivisen entsyymin ollessa läsnä, muokkaamattoman reportteripeptidin ja entsyymin muokkaaman vasta-peptidin sitoutuminen estyy ja luminesenssi-signaali laskee. Menetelmän toiminnallisuus ja nanomolaarinen herkkyys havainnollistettiin lukuisien eri entsyymien ja entsyymiryhmien kanssa.
Tämän jälkeen peptide-break teknologian toiminnallisuus ja monipuolisuus osoitettiin käyttämällä varauksellisia peptidejä leusiinivetoketju-peptidien sijasta. Näin helpotettiin peptidien suunnittelua, tinkimättä menetelmän suorituskyvystä. Lisäksi peptide-break teknologiasta kehitettiin lämpötilaan perustuva muunnos, jossa nostamalla entsymaattisesti muokattavan peptidin määrää kyettiin havainnoimaan huonon toiminnallisuuden omaavia entsyymejä. Tämän tutkimuksen perusteella, peptide-break teknologia soveltuu lukuisten PTM-ryhmien havainnointiin ja luo uudentyyppisen lähestymistavan, joka on hyödynnettävissä niin akateemisesti kuin teollisuudessakin
