The aging osteoblast : investigation mechanisms of osteoblast dysfunction with aging

Abstract

Die altersbedingte Osteoporose ist durch eine verminderte Knochenstärke charakterisiert und prädisponiert ältere Menschen zu einem erhöhten Frakturrisiko. Der Knochenverlust ist durch eine erniedrigte Knochenformationsrate im Verhältnis zur Knochenresorptionsrate gekennzeichnet. Auf zellulärer Ebene kann man eine Steigerung in der Anzahl und Aktivität der Osteoklasten feststellen, wobei die Generation und Funktion von Osteoblasten deutlich abnimmt. Obwohl die verminderte Funktion von Osteoblasten im Alter in zahlreichen Humanstudien und Tiermodellen gezeigt wurde, bleiben die Ursachen und die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen weitgehend unbekannt. In dieser Studie habe ich mögliche Ursachen (Teil I) und molekulare Mechanismen (Teil III), die zur verminderten Osteoblastogenese im Alter führen, sowie Konsequenzen der beeinträchtigten Osteoblastendifferenzierung untersucht (Teil II). Runx2 und Osterix sind essentielle osteoblastenspezifische Transkriptionsfaktoren. Der Einfluss des Alterns auf ihre Expression ist jedoch wenig erforscht. Weiters wurde der Wnt Signalweg als Regulator der Knochenmasse identifiziert, da er die Osteoblastogenese beeinflusst, und vor kurzem wurde dieser Signalweg mit altersassoziierten Prozessen in Verbindung gebracht. Der Einfluss des Alterns auf die Expression von Komponenten des Wnt Signalweges im Knochen bzw. in Osteoblasten wurde allerdings noch nicht untersucht. Ziel dieser Studie war daher die Untersuchung des Einflusses des Alterns auf die Genexpression von Runx2 und Osterix sowie auf extrazellulären Komponenten des Wnt Signalweges. Osteoblasten wurden aus dem Knochenmark von jeweils sechs männlichen C57BL/6 Mäusen gewonnen, die 6-Wochen, 6-Monate oder 18-Monate alt waren. Das Differenzierungspotential wurde mit einer Alizarin S Färbung untersucht. Die Genexpression von Runx2, Osterix, Wnt1, 3a, 4, 5a, 5b, 7b, 9b, 10b, LRP-5/6, sowie Dkk-1, Sklerostin, and sFRP-1 wurde mittels quantitativer RT-PCR im Knochengewebe sowie während der Osteoblastendifferenzierung analysiert. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Osteoblastendifferenzierung im Alter signifikant vermindert war. Die Expression von Runx2 und Osterix sowie sämtlicher Wnt Proteine im Knochen war in alten Mäusen vermindert. Reife Osteoblasten alter Mäuse verglichen zu jenen junger Mäuse zeigten eine signifikant erhöhte Expression von Wnt9b, LRP-6 und Dkk-1, wohingegen die Expression von Wnt5a und 7b vermindert war. Bei unreifen Osteoblasten führte das Altern zu einer vermehrten Expression on Wnt1, 5a, 5b und 7b, wohingegen die Expression von Runx2 und Osterix deutlich vermindert war. Die Genexpression von Wnt3a, 4, LRP-5 und Sklerostin blieb vom Altern unbeeinflusst. Unsere Ergebnisse zeigen dass die Expression von Runx2 und Osterix bei alten Mäusen vermindert ist und lassen daher eine mögliche Ursache der insuffizienten Osteoblastendifferenzierung schließen. Weiters konnten wir zeigen, dass das Altern die Expression jedes einzelnen osteoblastären Wnt Proteins individuell beeinflusst. Die größtenteils verminderte Expression von Wnt Proteinen im Knochengewebe unterstreicht die kürzlich entdeckte Assoziation des Wnt Signalweges mit dem Altern. Als nächstes wurde die altersabhängige Expression von RANKL und OPG untersucht, da diese Proteine maßgeblich an der Regulation der Osteoklastogenese beteiligt sind. Ihre Expression wurde im selben Ansatz wie oben beschrieben untersucht. Zusätzlich wurde die Expression genannter Gene in T Zellen untersucht. Die RANKL/OPG Ratio war im Knochen sowie in reifen Osteoblasten alter Mäuse tendentiell erhöht. Im Gegensatz dazu war die Anzahl der RANKL-positiven CD4+ und CD8+ T Zellen in jungen Mäusen erhöht. Folglich dürfte das gesteigerte Potential des Knochenmarks Osteoklasten zu generieren durch die erhöhte RANKL/OPG Ratio in Osteoblasten bedingt sein, während die RANKL-Produktion in T Zellen eine untergeordnete Rolle spielen dürfte. Der dritte Teil dieser Studie befasste sich mit der Untersuchung eines möglichen Mechanismus der zur alterbedingten Osteoblasteninsuffizienz führen könnte und auf dem Verlust des nukleären Proteins Lamin A/C basiert. Mutationen im Lamin A/C-Gen führen zum Hutchinson-Gilford Progerie Syndrom (HGPS), welches durch eine verfrühten Vergreisung sowie Osteoporose charakterisiert ist. In diesem Projekt habe ich die Rolle von Lamin A/C auf die Osteoblastendifferenzierung sowie auf mögliche sekundäre Auswirkungen auf die Osteoklastogenese untersucht. Dafür wurde die Expression von Lamin A/C während der Osteoblastendifferenzierung mittels siRNAs ausgeschaltet. Dies führte zu einer Verminderung der Osteoblastenproliferation um 26% und der Osteoblastendifferenzierung um 48%. Weiters zeigten Osteoblasten mit einer verminderten Expression von Lamin A/C eine reduzierte mRNA Expression von Runx2 und mRNA und Proteinexpression von Osteokalzin. Die Verminderung in der Expression von Lamin A/C führte außerdem zu einer Steigerung der RANKL/OPG Ratio. Dies führte zu einem erhöhten Potential der Osteoblasten die Osteoklastogenese zu fördern und war durch eine um 34% erhöhte Osteoklastenzahl gekennzeichnet. Die gewonnenen Daten zeigen, dass Lamin A/C essentiell ist für die Osteoblastendifferenzierung und dass eine Verminderung in der Lamin A/C Expression zu einer erhöhten Osteoklastogenese führt. Da Lamin A/C im Progeriesyndrom HGPS mutiert ist, decken meine Daten eine neue Verbindung zwischen einem verminderten Expressionsspiegel von Lamin A/C und einer insuffizienten Osteoblastendifferenzierung auf. Zusammenfassend konnte die vorliegende Studie zeigen, dass die Osteoblastendifferenzierung mit dem Alter abnimmt. Da das Altern zur einer verminderten Expression von verschiedenen Wnt Liganden und Lamin A/C führt und diese Faktoren essentiell für die Reifung und Funktion der Osteoblasten sind, kann davon ausgegangen werden, dass diese Mechanismen zur beeinträchtigten Reifung und Funktion der Osteoblasten im Alter beitragen.Age-related osteoporosis is characterized by compromised strength predisposing the elderly to an increased fracture risk. It is hallmarked by a decreased bone formation rate, relative to bone resorption, and is reflected by decreased osteoblastogenesis compared to osteoclastogenesis. Although impaired osteoblast function has been identified in various aging studies in humans and rodents, only few studies have been undertaken to investigate the molecular mechanisms of attenuated osteoblast differentiation. In this study we have assessed possible causes (part I) and consequences (part II) of impaired osteoblast differentiation with aging, as well as mechanisms involved (part III). Runx2 and osterix have been identified as essential osteoblast transcription factors, but their regulation with aging is poorly investigated. Moreover, the Wnt signaling pathway has been shown to be a major determinant of bone mass as it regulates osteoblastogenesis, and recently, this pathway has been linked to age-related processes. However, their age-related expression pattern has not been assessed in bone or osteoblasts. Thus, we have investigated the impact of aging on the mRNA expression of runx2 and osterix, and extracellular components of the Wnt signaling pathway in order to define possible causes of age-related impairment of osteoblastogenesis. Bone marrow cells were isolated from six male C57BL/6 mice, aged 6-weeks, 6-months, and 18-months. Osteogenic differentiation was induced for three weeks and assessed using alizarin red staining. Gene expression of runx2, osterix, Wnt1, 3a, 4, 5a, 5b, 7b, 9b, 10b, lipoprotein receptor-related protein (LRP)-5/6, as well as dickkopf-1 (Dkk-1), sclerostin, and secreted frizzled related protein-1 (sFRP-1) was determined in bone tissue and osteoblasts at days 7, 14, and 21 by real-time RT-PCR. We found that osteoblast differentiation was significantly reduced in aged mice. In bone tissue, expression levels of runx2 and osterix, and all Wnt genes assessed were decreased in old mice. Mature osteoblasts of aged compared to those of young mice showed enhanced expression of Wnt9b, LRP-6, and Dkk-1, and decreased expression of Wnt5a and 7b. In early osteoblasts, mRNA levels of Wnt1, 5a, 5b, and 7b were increased significantly in aged mice while those of runx2 and osterix were significantly decreased. The expression of Wnt3a, 4, LRP-5, and sclerostin was not altered in aged osteoblasts. In conclusion, the decreased expression of runx2 and osterix in aged animals may partially account for the impaired osteoblast differentiation seen with aging. Moreover, the osteoblastic expression of each Wnt-related protein is regulated individually by aging and the overall decreased expression of Wnt-related proteins in bone tissue of aged mice underlines the newly discovered association of Wnt signaling with aging. Secondly, we have assessed the age-related expression pattern of receptor activator of NFB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG), as they are critical osteoblast-produced regulators of osteoclastogenesis. The same study design as well as methodological approach as mentioned above was used. The RANKL/OPG ratio in bone tended to increase with aging. Mature osteoblasts from old animals displayed a higher RANKL/OPG ratio. Contrary, in young mice a higher percentage of CD4+ and CD8+ T cells expressed RANKL was apparent compared to adult and old ones. Nevertheless, our results suggest that the increased osteoclastogenic potential found in the bone marrow of old mice may be caused by the enhanced RANKL/OPG ratio in osteoblasts, which are the main producers of RANKL and OPG. Lastly, we have assessed mechanisms of age-related osteoblast insufficiency due to loss of the nuclear lamina protein lamin A/C. Recently, the Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS), a disease of accelerated aging and premature osteoporosis, has been linked to mutations in the gene encoding for lamin A/C. Here, we tested whether inhibition of lamin A/C in osteoblastic lineage cells impairs osteoblastogenesis and accelerates osteoclastogenesis. Lamin A/C was continuously knocked-down using small interfering (si)RNAs in human mesenchymal stem cells (MSCs) differentiating towards osteoblasts. Lamin A/C knock-down led to an inhibition of osteoblast proliferation by 26%, and impaired osteoblast differentiation by 48% based on mineralized matrix formation assessed with alizarin red S staining. Expression levels of runx2 and osteocalcin mRNA were decreased in mature lamin A/C-knock-down osteoblasts by 44% and 78%, respectively. Furthermore, Western blot analysis showed that osteoblasts with diminished levels of lamin A/C also produced less osteocalcin. Lamin A/C inhibition increased the RANKL/OPG ratio at mRNA and protein levels, resulting in an enhanced ability to support osteoclastogenesis, as reflected by a 34% increase of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positive multinucleated cells. Our data indicate that lamin A/C is essential for proper osteoblastogenesis and therefore may link lamin A/C to age-related impairment of osteoblast differentiation. Moreover, lack of lamin A/C favors an osteoclastogenic milieu, and results in enhanced osteoclastogenesis. Taken together, our study demonstrates that aging negatively affects osteoblast differentiation. We propose that this may be the result of the down-regulated expression of various Wnt ligands and lamin A/C, which both have been shown to be vital factors for osteoblast differentiation and function.submitted by Martina RaunerWien, Med. Univ., Diss., 200