Mechanisms involved in ischemic conditioning of the heart evaluated in reperfused porcine model of myocardial infarction

Abstract

Ischämische Konditionierung ist ein Konzept, bei dem kurze Episoden von sublethaler Ischämie/Reperfusion (I/R) vor oder nach einem Myokardinfarkt (MI) induziert werden, um Ischämie- und Reperfusionsschäden zu verringern. Diese kardioprotektive Konditionierung stimuliert Genexpressionsänderungen, posttranskriptionelle Vorgänge und parakrine- humorale Reaktionen, die zusammen das Herzgewebe gegen Ischämie schützen können. Obwohl die Konditionierung des Myokardiums eine viel versprechende Strategie gegen Ischämie/Reperfusionsschäden in Tierexperimenten ist, konnte eine klinische Verwendung keine zufriedenstellenden Resultate erreichen. Die primären Fragestellungen dieser Doktorarbeit waren (1) die Mobilisierungskapazität von CD34-positiven Zellen und die Sekretion von chemotaktischen Zytokinen im Großtiermodell im Schwein bei ischämischer Präkonditionierung (IPreC) und Postkonditionierung (IPostC) zu untersuchen; (2) den Effekt von IPostC auf die ventrikuläre Funktion und die Infarktgröße zu bestimmen; und (3) die Analyse des Transkriptoms von Myokardproben durchzuführen und die globale Genexpression zwischen IPostC und MI in Bezug auf zeitliche Änderungen und Region des Myokards zu vergleichen. Daher haben wir Konditionierungsimpulse vor und nach dem MI im translationalen Schweinemodell der akuten Myokardischämie mit anschließender Reperfusion bei geschlossenem Brustkorb eingesetzt. Die Tiere wurden in IPostC, IPreC, non-konditionierte MI und scheinoperierte Gruppen randomisiert. Die ventrikuläre Funktion wurde vor der Intervention, sowie nach drei Stunden und drei Tagen mit Echokardiographie untersucht und nach drei Tagen mit kardialer MRT evaluiert. Weiters wurden FACS Analysen zur Bestimmung der regenerativ CD34+ Zellzahl durchgeführt und die Konzentrationen von chemotaktischen Zytokinen bestimmt. Durch Verwendung von Next Generation Sequencing (NGS) Technologien haben wir die Auswirkung von IPostC auf die gesamte Genexpression im ischämischen und nicht-ischämischen (remote) Myokard im Schweinemodell untersucht. Wir konnten zeigen, dass IPreC die Sekretion von chemotaktischen Zytokinen und die Auswanderung von CD34+ Zellen steigert. Im Gegensatz dazu hatte IPostC keinen Einfluss auf die Migration von blutbildenden Zellen. Wir konnten zeigen, dass die Regulation der MMP-2 Sekretion durch IPreC invers reguliert wird, und vermehrt zu anti-ischemischen Effekten beitragen kann. Im Vergleich zu unbehandeltem MI, reduzierte IPostC unabhängig von der Infarktgröße das myokardiale Ödem und die mikrovaskuläre Obstruktion. Die Analyse des Transkriptoms zeigte, dass die Komponenten des “p o-survival kinas ” Signa w gs, Phosphoinositid-3-Kinasen- Akt Signalwegs und „survival activating factor enhancement“ Signalwegs in MI und IPostC in beiden Zeitfenstern und myocardialen Zonen ähnlich reguliert sind. Die weitere bioinformatische Analyse ergab nach drei Tagen in der IPostC Gruppe eine signifikante Überexpression von Genen, die an der Regulation der fokalen Adhäsion beteiligt sind und die down-regulierte Expression von Transkripten, die in der Aktivierung von Blutzellen, sowie in Hypertrophie und Kardiomyopathie involviert sind. All dies deutet darauf hin, dass die IPostC auf mikrovaskulärer Ebene wirkt. Unsere Ergebnisse liefern Beweise für die Kapazität der IPreC eine humorale Reaktion zu stimulieren. Die erhaltenen funktionellen Daten und Analysen des Transkriptoms zeigen eine potenzielle Kardioprotektion der IPostC in Bezug auf einen positiven Effekt ausschließlich auf Ebene der Mikrogefäße.Transient episodes of sublethal ischemia/reperfusion (I/R) represent conditioning stimuli aiming to render the myocardium more resistant against subsequent ischemia/reperfusion (I/R) injury. Stimulation of cardioprotective processes at the level of gene expression, protein post-transcriptional modifications, and paracrine-humoral responses may synergistically protect the tissue subjected to ischemia. Although the concept of ischemic conditioning showed a promising strategy to attenuate reperfusion-induced injury in pre-clinical animal models, translation to clinical scenarios has not met with much success. The primary aims of this doctoral thesis were: (1) to assess whether ischemic preconditioning (IPreC) or postconditioning (IPostC) stimuli induce mobilisation of regenerative CD34+ cells and the release of chemotactic cytokines in a clinically relevant porcine model of reperfused myocardial infarction (MI); (2) to evaluate the effect of IPostC on left ventricular (LV) function and infarct size; and (3) to analyse transcriptome of the myocardium affected by IPostC and to compare transcriptional pattern with the MI model, particularly with respect to the time window and myocardial regions. To achieve these aims, we applied conditioning stimuli prior to, or after, prolonged MI in closed-chest reperfused swine models in IPostC and IPreC groups, respectively. Animals were randomised in the IPostC, IPreC, non-conditioned MI and sham-operated control groups. We assessed LV function at the baseline, three hours and three days follow-up by echocardiography and at three days follow-up by cardiac MRI. To address the cell mobilisation in IPreC and IPostC we measured the absolute cell count of CD34+ cells by FACS analysis and evaluated the release of associated chemotactic cytokines. Applying the next generation sequencing approach, we analysed the gene expression changes in the transcriptome of the IPostC and MI models. Our group has shown that IPreC, but not IPostC, induces the release of chemotactic cytokines and egression of CD34+ hematopoietic cells into peripheral circulation in the late phase of cardioprotection. We found opposite regulation of MMP-2 plasma release in IPostC and IPreC, which may contribute to the cardioprotective effect of IPreC. Compared to MI, IPostC was associated with protection on a microvascular level with attenuated oedema and microvascular obstruction independently from changes in infarct size. Overall, the expression of genes involved in pro-survival kinase pathway, phosphatidylinositol 3-kinase-Akt signalling, and survivor activating factor enhancement pathways were mostly similar in IPostC and MI experimental groups in both time windows and tissue regions. However, we observed significant deregulation of gene sets enriched in focal adhesion pathway in the late window of cardioprotection after IPostC. Transcripts involved in adhesion and activation of blood cells, cardiac hypertrophy and cardiomyopathy were downregulated, indicating a beneficial effect of IPostC on microvasculature. Thus, using a swine model of MI, we have demonstrated that mobilisation of CD34+cells and release of chemotactic cytokines contributes to IPreC, but not IPostC, cardioprotection. The data obtained by cMRI measurements and transcriptome analysis suggests that the potential cardioprotective effect of IPostC is limited to changes on a microvascular level.submitted by MSc Dominika LudovicZusammenfassung in deutscher SpracheAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität, Dissertation, 2016OeB