The role of the dynamic flavivirus surface in virus entry

Abstract

Zu den Flaviviren zählen viele wichtige humanpathogene Erreger, wie das Frühsommer-Meningoenzephalitis- (FSME), West Nil-, Gelbfieber- und Zika-Virus sowie die Dengue-Viren. Diese kleinen umhüllten Viren werden von Arthropoden übertragen und können eine Vielzahl an Zellen von Vertebraten und Invertebraten infizieren. Das Hauptoberflächenprotein E spielt eine entscheidende Rolle während des Zelleintritts. Es vermittelt die Bindung des Virus an die Zelloberfläche und die von saurem pH induzierte Fusion der viralen und endosomalen Membran nach Rezeptor-vermittelter Endozytose. Eine Reihe von zellulären Oberflächenmolekülen wurden bereits als Anheftungsfaktoren identifiziert, aber ihre spezifische Rolle während der Virusaufnahme ist in den meisten Fällen noch ungeklärt. Außerdem können Flaviviren Fc-Rezeptor-positive Zellen durch die Aufnahme von infektiösen Virus-Antikörper-Komplexen infizieren, wobei sie keinen „echten“ Virus-spezifischen Rezeptor benötigen. Neueste Hinweise legen nahe, dass die E-Homodimere an der Virusoberfläche in ständiger dynamischer Bewegung („virus breathing“) sind, was zu einer vorübergehenden Exposition von verborgenen Strukturen führen kann, die in einer starren Virushülle nicht zugänglich wären. Diese „kryptischen“ Regionen könnten dann aufgrund der beweglichen Virushülle potentiell mit zellulären Liganden interagieren. In dieser Dissertation untersuchten wir die Rolle der dynamischen Oberfläche des FSME-Virus in Bezug auf die Zellbindung und deren Einfluss auf die Infektiösität. Insbesondere adressierten wir diese Frage durch Analysen von möglichen Effekten von E-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mak) auf a) die Dynamik von Viruspartikeln, die zu Änderung in der Oligomerstruktur von E führen können, b) das Eindringen des Virus in die Zelle und c) die Infektion von primären bzw. permanenten Zellen. Eine Vorinkubation des FSME-Virus mit einem mak (mak A5), der ein Epitop in der E-Dimer-Grenzfläche („interface“) erkennt, erhöhte die Zellbindung, die auch zu einer verstärkten Infektion führte. Wie wir mittels biochemischer Analysen zeigen konnten, dissoziierte mak A5 das E-Dimer und führte zu einer Exposition des Fusionspeptids (FP), das normalerweise bei neutralem pH in der dimeren E-Proteinstruktur verborgen ist und nur in den Endosomen bei sauren pH exponiert wird, um die Membranfusion einzuleiten. Des Weiteren wiesen wir nach, dass die mak-induzierte FP-Exposition für die erhöhte Bindung an die Plasmamembran verantwortlich ist, aber nicht die Membranfusion auslösen kann. Aus diesen Daten schließen wir, dass die beobachtete Verstärkung der Infektion durch eine erhöhte Partikelaufnahme verursacht wurde. In dieser Arbeit beschreiben wir die Identifizierung eines neuen Mechanismus der Antikörper-induzierten Verstärkung der Infektion von Flaviviren, der unabhängig von Fc-Rezeptoren ist. Er beruht auf der Exposition des verborgenen FPs und dessen Interaktion mit der Wirtsmembran bereits in der Phase der Virusbindung. Flavivirus-Antikörper-Interaktionen mit ähnlichen Effekten könnten auch eine Rolle in polyklonalen Antikörperantworten spielen und daher potentiell zu einer Veränderung des Infektionsverlaufs führen, besonders wenn bereits Antikörper aus vorangegangen Infektionen mit verschiedenen Flaviviren vorhanden sind.Flaviviruses comprise a number of important human pathogens such as tick-borne encephalitis (TBE), West Nile, yellow fever, Zika and dengue viruses. They are small enveloped, arthropod-borne viruses and can infect a wide variety of cells from vertebrate and invertebrate host species. The major envelope protein E is crucial for the mechanisms of cell entry. It mediates binding to the cell surface as well as low-pH-induced fusion of the viral and endosomal membrane after uptake by receptor-mediated endocytosis. Several cellular attachment factors have been identified, but their specific role in virus entry is still obscure in many instances. Flaviviruses can also infect Fc receptor-positive cells through the internalization of infectious virus-antibody complexes, thereby bypassing the requirement for a “true” virus-specific receptor. Recent evidence has suggested that the E homodimers on the virus surface are in dynamic motion (“virus breathing”), leading to the transient exposure of sites that would be cryptic in a rigid particle, but can potentially interact with cellular ligands due to the breathing of the viral envelope. In this PhD thesis, we investigated the role of the dynamic surface of TBE virus (TBEV) in virus-cell binding and its impact on infectivity. Specifically, we addressed this question by analyzing the possible effect of E-specific monoclonal antibodies (mabs) on particle dynamics that would affect the oligomeric structure of E, virus entry as well as infection of primary and permanent cell lines. Pre-incubation of TBEV with a mab (mab A5), recognizing an epitope at the E dimer interface, enhanced binding to cells, which also resulted in increased infectivity. As revealed by biochemical analyses, mab A5 dissociated the E dimer and led to the exposure of the fusion loop (FL), which is normally buried in the dimeric E protein structure at neutral pH and becomes exposed only at the low pH in endosomes to initiate membrane fusion. We could demonstrate that the mab-induced FL exposure was responsible for enhanced binding to the plasma membrane, without leading to membrane fusion. Therefore, we conclude that the observed enhancement of infectivity was caused by an increase in particle uptake. In summary, we have identified a novel mechanism of antibody-induced enhancement of infection of flaviviruses, which is independent of Fc receptors, but is mediated by the exposure of the otherwise cryptic FL and its insertion into the host membrane already at the stage of viral attachment. Flavivirus-antibody interactions with similar effects can also occur in the context of polyclonal antibody responses and therefore have the potential to modulate the course of infection, especially when pre-existing antibodies are present in sequential infections with different flaviviruses.submitted by Denise Angelika HaslwanterAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersMedizinische Universität Wien, Diss., 2018OeBB(VLID)257757