Guber, A.

Halstenberg, S.

Herrmann, D.

Kautt, M.

Moss, D.

Muslija, A.

KITopen

Die Miniaturisierung von Analyse-techniken und analytischen Me-thoden ist kein Selbstzweck. Viel-mehr handelt es sich um einenTrend, der einerseits der Notwen-digkeit, zunehmend sparsamermit Reaktionslösungen umzuge-hen, unterliegt und andererseitseine Reihe von analytischen Vor-teilen erschließt, die konventio-nellen Techniken aufgrund ihrermakroskopischen Dimension ver-schlossen sind. So ist es auchkein Wunder, dass im aktuellenTrendbericht zur AnalytischenChemie 2001 in den „Blauen Blät-tern“ (Nachrichten aus der Che-mie) neben biochemischen Nach-weismethoden die „verstärkteNutzung miniaturisierter Techni-ken, selbst in Gebieten, die bis-lang als Domäne des klassischenApparatebaus galten“, beobach-tet werden [1]. Bis dann aber dieVision eines Laboratoriums aufeinem Chip – als sog. „lab-on-a-chip“ bezeichnet und vergleichbarzu den Prozessorchips der Com-puterindustrie gemeint – realisiertsein wird, bleibt noch einiges zutun. Fest steht jedoch bereits heu-te, über ein Jahrzehnt nachdemzum ersten Mal das Konzept derauch als „µTAS1)“ bezeichnetenAnalyseneinheiten formuliert wur-de [2], dass mikrotechnische undhier insbesondere mikrofluidischeProzesse den Schlüssel zum Auf-bau neuartiger miniaturisierterAnalysenverfahren bilden. Unddass diese wahrscheinlich dieMethoden der Umwelt- Lebens-mittel- und anderer Analytiken bishin zur medizinischen Diagnostikverändern werden [3].Die Miniaturisierung von analy-tischen Verfahren verspricht da-bei ganz allgemein eine Reihevon Vorteilen, wiel Verkürzung von Analysen-zeiten,l Erhöhung der Qualität derAnalysenergebnisse,l Parallelisierung von funktiona-len Komponenten und Integra-tion von Funktionen,l Verringerung des Bedarfs anProbe und Reagenzien undsomit weniger anfallenderAbfall,l Verminderung entstehenderKosten,l Portabilität miniaturisierterSysteme.Wobei natürlich nicht übersehenwerden darf, dass Miniaturisie-rung alleine nicht gleich alles bes-ser macht. Hier sind auf die jewei-ligen Anwendungen abgestimmteLösungen zu entwickeln und glei-chermaßen eine einzelfallabhän-gige Priorisierung der vorstehen-den möglichen Voreile vorzuneh-men. So sind nicht alle Vorteileimmer in Einklang zu bringen.Beispielsweise ist es eher un-wahrscheinlich, dass eine mikro-technische Analysen-Einheit, diemehrere Funktionen integriert,auch gleichzeitig sehr kosten-günstig ist, wenngleich sie aberwahrscheinlich eine bessere ana-lytische Leistung im Vergleich zueinem Aufbau zeigt, der aus Ein-zelkomponenten besteht.Ein unbestritten positives Beispielfür den Nutzen der Miniaturisie-rung in der Analytik stellt die chro-matographische Trennung dar. Soist die bei Kombination miniaturi-sierter Kanalgeometrien mit elek-trokinetischen Effekten erreichba-re erhöhte Trennleistung durch ei-ne Verringerung charakteristi-scher Dimensionen bedingt undermöglicht damit die Steigerungder Qualität des Analysenergeb-nisses [4]. Wobei festgestellt wer-den muss, dass diese auch vonder Empfindlichkeit der eingesetz-ten Detektionsverfahren abhängt.Um abschließend die eingangsgestellte Frage zu beantworten:Heute passt ein Analysenlaborwohl noch nicht auf einen Chip.Aber wie Abb. 1 zeigt, passt einemögliche Einzelkomponente ei-nes künftigen mikrofluidischenAnalysenchips immerhin schonmal auf einen Finger. So werdendenn gemeinsame Entwicklun-gen an der Schnittstelle von Mi-krofluidik und Nanotechnik sowieBiosensorik, Mikroelektronik undInformatik in Zukunft Neuerungeninsbesondere in den BereichenSimulation, Fertigungsverfahren,Oberflächenmodifikation undNachweismethoden generieren,die uns dem Labor im Chipformatdamit näher kommen lassen. Passt ein Analysenlaborauf einen Chip?183(183)Die Vision des schrumpfenden Labors: Mikrofluidische Lösungen für analytischeAnwendungen in den Life SciencesM. Kautt, MIKRO; S. Halstenberg, IAI; D. Moss FGS; A. Guber, D. Herrmann, A. Muslija, IMTNACHRICHTEN - Forschungszentrum Karlsruhe  Jahrg. 34  2-3/2002  S. 183-189 1) Miniaturized Total Analysis SystemAbb. 1: Kapillar-Elektrophorese-Einheit inKunststoff abgeformt und zum Größenver-gleich auf einem Finger platziert.Unter Mikrokapillaren verstehtman allgemein geschlosseneKanäle, deren (in der Mikrosys-temtechnik meist rechteckiger)Querschnitt etwa in der Größen-ordnung eines menschlichenHaares liegt (rd. 60 m m). Sie bil-den die Grundlage für mikrofluidi-sche Komponenten, die nebenden Kapillaren noch weitere funk-tionstragende Teile besitzen, de-ren geometrische Abmessungenim Bereich zwischen 10 und eini-gen 100 Mikrometern liegen. Sol-che mikrofluidischen Systeme fürbioanalytische Anwendungenwerden typischerweise planaraufgebaut. Man spricht hier oftvon sogenannten „Analysen-Chips“. Abb. 1 zeigt eine Einheiteines weiter unten beschriebe-nen Analysen-Chips im Vergleichzu den papillaren Linien einesFingers.Effiziente Simulations-verfahren für komplexemikrofluidische SituationenBeim Entwurf von fluidischen Mi-krosystemen bzw. -komponentenreduziert der Einsatz rechnerge-stützter Werkzeuge den Entwick-lungsaufwand bedeutend undhilft, die gewünschten Fließeigen-schaften vorherzusagen und re-produzierbar einzustellen.Dringt eine Flüssigkeit in einenstrukturierten Mikrokanal ein unddrängt dabei ein anderes Fluidaus dem Kanal heraus, so musseine transiente, d. h. sich wäh-rend der Betrachtung verändern-de, Mehrphasenströmung be-trachtet werden unter Berück-sichtigung der freien Oberflächeund der Kapillarkraft. Das Voran-schreiten der Flüssigkeit geht miteiner Änderung der Grenz-flächenform einher und ist damitaufgrund der meist hohen Kom-plexität der Geometrie analytischnicht hinreichend erfassbar. ZurNachbildung des Strömungsver-haltens können nun jedoch Simu-lationsmethoden, wie z. B. die Fi-nite Volumen Methode (FVM),eingesetzt werden, die eine hoheDiskretisierung des Strömungs-raums vornehmen und so in ihrenErgebnissen analytischen Lösun-gen hinreichend nahe kommen.Um den hohen zeitlichen Aufwandbei der Simulation komplexer Geo-metrien zu reduzieren, wurde amForschungszentrum ein Konzeptzur Erstellung eines geeignetenGesamtmodells erarbeitet [5]. Da-bei wird das Strömungsproblem inmehrere Bereiche unterteilt, wobeifür jeden Bereich Modelle auf phy-sikalischer Modellebene (z.B.FVM-Modelle) erstellt werden. Ausden Simulationsergebnissen wer-den Modelle einer höheren Mo-dellebene, z. B. Netzwerkmodelle,verbessert oder generiert. Das be-deutet, dass sich die Komplexitätdes Gesamtproblems zunächstdurch die Aufteilung in mehrereuntergeordnete Bereiche redu-ziert. Nachfolgend werden die Si-mulationsergebnisse dazu einge-setzt, das Gesamtproblem auf ei-ner höheren Modellebene, z. B.mit einem Netzwerkmodell, zu be-schreiben. Im Gegensatz zu denModellen auf physikalischer Ebe-ne besitzt das höhere Modell desGesamtproblems einen geringe-ren Simulationsaufwand. Diesführt somit in kürzerer Zeit zu nutz-baren Ergebnissen.Zur Unterteilung des Strömungs-gebietes in die zu modellierendenBereiche wird die Symmetrie der Struktur ausgenutzt (sieheAbb. 2). Ein entsprechendes para-metrisierbares FVM-Modell wirderstellt, das in den vom Entwicklervorgegebenen Parametern vari-Modellierung des Ver-haltens von strömendenFlüssigkeiten in Mikro-kapillaren184(184)Abb. 2: Funktionseinheit (Ausschnitt) eines als medizinischer Teststreifenvorgesehenen Analysenchips (Abbildung mit freundlicher Genehmigung derSTEAG microParts GmbH, Dortmund).iert werden kann. Die Generie-rung des Modells aus den Geo-metrieangaben erfolgt dann auto-matisch. So können in dem abge-bildeten Beispiel verschiedeneGeometrieparameter, die die Säu-lenstruktur die (z. B. Säulenhöhe,Säulendurchmesser) beschrei-ben.Vor der Durchführung einer Simu-lation sind die Eingabe- und Aus-gabegrößen festzulegen. Wennwie im Falle einer einphasigenStrömung die Abhängigkeit des re-sultierenden Volumenstroms vonder anliegenden Druckdifferenzerfasst werden soll (Abb. 3 a),dann dienen als Referenzdatenzur Erstellung des höheren Mo-dells Simulationsergebnisse fürunterschiedliche Druckdifferenzenund unterschiedliche Säulen-höhen (Abb. 3 b).Weitere Arbeiten zur modellhaf-ten Beschreibung und zur Simula-tion von Strömungen in Kapillarensind dem Beitrag von Ehrhard etal., ebenfalls in diesem Band, zuentnehmen [6].High-Throughput-Screening (zuDeutsch etwa „Hochdurchsatz-Ausleseprüfung“) ist eines derSchlagworte bei der Suche nachbesseren Wirkstoffen für neueMedikamente. Allgemein verstehtman darunter das vollautomati-sierte Testen vieler niedermoleku-larer Verbindungen auf bestimm-te biologische Wirkungen hin.Das am Forschungszentrum ent-wickelte Screening-Verfahrennutzt aus, dass eine Interaktionzwischen einem Arzneimittelkan-didat und einem sogenannten„Targetprotein“ zu einem Kom-plex führt und sich hierdurch Än-derungen in den Schwingungsei-genschaften der Moleküle erge-ben. Diese Molekül-Schwingun-gen können mittels FTIR-Spek-troskopie (von Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie) bestimmtwerden. Vergleicht man nun zweiZustände, wie etwa das Sum-menspektrum aus ungemischtenTarget- und Arzneimittelkandidat-Lösungen mit dem Spektrum derMischung, muss im Falle einer In-teraktion, die dann einen starkenHinweis auf die mögliche Eignungdes Kandidaten als Wirkstoff ge-ben würde, ein anderes Spektrumresultieren (Abb. 4). Da es sichauch bei einer Interaktion nur umsehr kleine strukturelle Änderun-gen handeln wird, wurde mit dersogenannten Differenzspektro-skopie eine empfindliche Metho-de entwickelt, die auch kleinsteUnterschiede noch sichtbarmacht.Das Verfahren nutzt dabei also in-trinsische optische Eigenschaftender Proteine im mittleren Infrarot-Spektralbereich aus, so dass eineDetektion von Protein-Arzneimit-tel-Wechselwirkungen ohne zu-sätzliche Markierung, Färbungoder Immobilisierung möglich ist.Exemplarisch sind in Abb. 5 an-hand der Wechselwirkung zwi-schen dem Enzym Trypsin undMikrofluidische Dünnschichtzelle für das High-Throughput-Screening185(185)Abb. 3: a) Darstellung des simulierten Volumenstroms zwischen den Säulen in Abhängigkeit der Druckdifferenz;b) Simulationsergebnisse für unterschiedliche Druckdifferenzen unterschiedliche Säulenhöhen. Diese dienenals Referenzdaten zur Erstellung des höheren Modells.Durchfluss [m3 /s]1e–099e–108e–107e–106e–105e–104e–103e–102e–101e–1000 500 1000Differenzdruck [Pa]Säule 75uSäule 50uSäule 25u1500 2000 2500fünf verschiedenen niedermole-kularen Verbindungen die resul-tierenden Differenzspektren ge-zeigt.Man erkennt nur in drei Fällen einausgeprägtes Differenzspektrum,was auf eine Interaktion hindeu-tet. Die als Kontrollsubstanzeneingesetzten Säuren zeigen kei-ne nennenswerten Differenzen,also auch keine Interaktion. Trotz der analytischen Leistungs-fähigkeit des Verfahrens ließ ersteine mikrotechnische Entwick-lung die FTIR-Differenzspektro-skopie zu einer auch kommerziellbeachteten Technik werden. Somuss nämlich bei wässrigen Lö-sungen – und hierum handelt essich im Pharmascreening übli-cherweise – die starke Absorptionvon Infrarotlicht durch das als Lö-sungsmittel dienende Wasserberücksichtigt werden. Dahermüssen die Messungen bei eineroptischen Weglänge und damitSchichtdicke einer Messzelle vonhöchstens 10 µm erfolgen. DasFördern von wässrigen Protein-lösungen durch derart dünne186(186)Abb. 4: Prinzip des Nachweises der Komplexbildung zwischen Proteinen und Arzneimittel-Kandidaten mittelsFTIR-Spektroskopie. Aufgrund der Komplexbildung unterscheiden sich das Summenspektrum und das Mi-schungsspektrum.Target-ProteinArzneimittel-KandidatSummen-spektrumMischungs-spektrumKomplexAbb. 5: FTIR-Differenzspektren, die durch Mischung des EnzymsTrypsin mit Hemmstoffen (obere 3 Spektren) bzw. mit Kontroll-substanzen (untere 2 Spektren) erhalten wurden.BenzamidinLeupeptinPropionyl-LeupeptinBenzoesäureHydroxyzimtsäure∆A = 0.0011900 1800 1700 1600 1500Wellenzahl [cm–1]1400 1300 1200Schichten erzeugt jedoch Drückein der Messzelle bis etwa 25 bar.Da nun die Strukturänderungenim Protein, und daher auch die zuerfassenden Spektraländerun-gen, extrem klein sind, bedeutetdies, dass es auch bei hohemDruck zu keiner Änderung derSchichtdicke kommen darf. Be-reits eine Schichtdickenänderungvon 10 nm würde zu einem unak-zeptabel großen Störsignal füh-ren. Hierzu musste eine neuartigemikrofluidische Durchflusszelleentwickelt werden, die zwi-schenzeitlich unter den NamenAquaSpec™ von einem Startup-Unternehmen, an dem auch zweiehemalige Doktoranden des For-schungszentrums beteiligt sind,vertrieben wird (Abb. 6).Für die Entwicklung neuer Medi-kamente werden heute in derpharmazeutischen Industrie typi-scherweise mehr als 100.000Substanzen pro Woche auf ihreWirksamkeit hin überprüft. Dabeikommen vorzugsweise Mikrotiter-platten aus Kunststoff als groß-flächige Testplattformen zum Ein-satz. Diese enthalten auf einerstandardisierten Grundfläche von125 mm x 85 mm, mehrere hun-dert bzw. tausend individuelle, mi-niaturisierte Reaktionskammern,sogenannte Wells. Konventionel-le, am Markt befindliche Mikroti-terplatten besitzen 96, 384 oder1536 Wells, wobei das Well-Volu-men zwischen 1 ml und 12 µl liegt.Dabei stellt generell das Handlingvon sehr kleinen Probenvoluminaim Mikroliter-Bereich ein erhebli-ches Problem dar, da Verduns-tungseffekte immer mehr zumTragen kommen. Durch den Ein-satz von gekammerten mikroflui-dischen Kanalsystemen anstelleder offenen Wells werden die Ver-dunstungseffekte deutlich mini-miert. Das bietet zudem die Mög-lichkeit, in den Mikrokanälenkleinste Probenmengen aufzuar-beiten, zu trennen oder sie mitweiteren Substanzen zu vermi-schen. Diese als Lab-on-a-Chipbezeichneten Systeme zeichnensich aufgrund der kleinen Ka-nalabmessungen auch durch ei-nen sehr geringen Chemikalien-verbrauch aus.Mit mikrotechnischen Fertigungs-methoden konnten erstmalig Mikrotiterplatten im Standardfor-mat aus Kunststoff mit 96 gleich-artig ausgebildeten mikrofluidi-schen Strukturen realisiert wer-den (Abb. 7), die in ihrem prinzipi-ellen Aufbau Kapillarelektropho-rese-Einheiten entsprechen. DieWahl von Kunststoff, im Vergleichzu anderen in der Mikrosystem-technik gängigen Materialien, er-laubt dabei den Zugang zu poten-tiell kostengünstigen Analysen-chips. Neben der allgemein für ei-ne kommerzielle Nutzung erfor-derlichen hohen Wirtschaftlichkeiteröffnet sich hierdurch, die Mög-lichkeit, komplexe mikrofluidischeKomponenten auch als Einweg-komponente zu ge- und verbrau-chen. Hier bietet Kunststoff einer-seits die Möglichkeit, bis zu 2Größenordnungen günstiger seinEine Mikrotiterplatte aus Kunststoff mit 96integrierten mikro-fluidischen Strukturen187(187)Abb. 6: AquaSpec™-Zelle (Abbildung mitfreundlicher Genehmigung der Fa. micro-biolytics, Freiburg).Abb. 6: AquaSpec™-Zelle (Abbildung mit freundlicher Genehmi-gung der Fa. micro-biolytics, Freiburg).zu können als mit anderen Mate-rialien [7]. Andererseits zeichnensich Kunststoffe durch eine fürMassenprodukte vorteilhafte ho-he Toleranz gegenüber mechani-scher Belastung, eine hohe Mate-rialvielfalt und die Möglichkeit zurvielseitigen Modifizierung derOberflächen aus. Jede der 96 Mikrokanal-Strukturenbesteht aus zwei sich kreuzendenMikrokanälen, an deren Ende sichjeweils Zugangsöffnungen (Reser-voirstrukturen) zur Aufnahme vonProbenmaterial befinden. DieKanäle sind jeweils 100 µm breitund 50 µm tief. Im Kreuzungsbe-reich beträgt das Volumen etwa600 pl. Die Trennstrecke ist ausPlatzgründen mäanderförmig an-geordnet und ist insgesamt 40 mmlang. Um das zu analysierendeProbengemisch definiert bewegenund trennen zu können, werdenelektrische Spannungen angelegtund über elektrische Leiterbahnenan die Reservoire geführt. Die elektrische Kontaktierung al-ler 384 Reservoirbereiche erfolgtüber Leiterbahnen, die in die mi-krostrukturierte Kunststoffplatteintegriert sind (Abb. 8). Füllt manden langen Kanal mit Agarose-Gel, können durch Anlegen eineselektrischen Feldes geringe Men-gen eines Probengemischs in dasKanalsystem eingeschleust undgetrennt werden. Dies ist anhanddes Standfotos einer Videose-quenz in Abb. 9 gezeigt. Erfolgtdies bei allen 96 Strukturen zurselben Zeit, so können parallelTrennungen von Substanzgemi-schen durchgeführt werden.Es wurde gezeigt, wie neuartigerechnergestützte Simulationsmit-tel helfen, das Potenzial mikroflui-discher Strukturen zum Aufbauvon neuartigen Analysenchips invertretbarer Zeit und mit vertret-barem Rechenaufwand in kon-krete Geometrien und Designvor-schläge umzusetzen. Weiterhinwurden Beispiele vorgestellt, umbereits heute die Menge an kost-barem Probenmaterial und die er-forderliche Reaktandenmenge ineiner Analyse zu reduzieren, beigleichzeitiger Erhöhung der Zahlan Untersuchungen. Die Mikro-fluidik wurde anhand von erstenEntwicklungsbeispielen vorge-stellt als eine Schlüsseltechnikauf dem Weg zu hochintegriertenAnalysensystemen, die in ihrerzukünftig vollständigen Ausprä-gung zu als µTAS oder Lab-on-a-Chip-Systeme bezeichneten Ana-lysenverfahren führen sollen.Dem Bundesministerium für Bil-dung und Forschung gilt der Dankder AutorInnen für die Förderungdes Verbundprojektes OMID(„Optimierung von Mikrosyste-men für Diagnose- und Überwa-chungsanwendungen“), in des-sen Verlauf die hier dargestelltenErgebnisse zur Simulation erar-beitet wurden. Weiterer Dank giltden Projektpartnern STEAGmicroParts GmbH und UniversitätBremen für Ihre hervorragendenBeiträge.Die Arbeiten zur Entwicklung ei-ner Dünnschichtzelle für dieFTIR-Spektroskopie hätten ohnedie Beiträge von Kathrin Füchsle,Ralf Masuch und Andreas Wolf(die beiden letztgenannten vonder micro-biolytics GmbH, Frei-burg) nicht zu den gezeigten Er-folgen führen können.Wir bedanken uns bei Dr. An-dreas Gerlach von der GreinerBio-One GmbH für die sehr guteZusammenarbeit und den Kolle-gen Dr. Mathias Heckele und Tho-mas Schaller für die unverzicht-bare Unterstützung.DanksagungZusammenfassung188(188)Abb. 8: Die elektrische Kontaktierung dervier Reservoire jeder mikrofluidischen CE-Struktur erfolgt durch aufgedampfte Lei-terbahnen aus Gold (Abbildung mit freund-licher Genehmigung der Firma GreinerBio-One, Frickenhausen). Abb. 9: Der im Kreuzungsbereich generier-te Pfropf einer Farbstoff/DNA-Mischungwandert nach dem Anlegen einer elektri-schen Spannung nach rechts in den Trenn-kanal. An der unteren Kanalseite erfolgteein Abriss, während von oben noch Sub-stanz mitgezogen wird.189(189)[1] R. Nießner, J. Broekaert, J. W. Einax,H. Emons, W. Engelwald, K. Heumann, H. Hutter, D. Knopp, R. Krska, U. Panne, U. Pyell, R. Salzer, F. Scheller, W. Stöcklein,N. Trautmann, M. Weller, Nachr. Chemie 50 (4/2001) 455-464 und 483-487[2] A. Manz, N. Graber, H. M. WidmerSensors and Actuators B1 (1990)244-248[3] J. M. Ramsey Nat. Biotech. 17 (1999) 1061-1062 [4] C. S. Effenhauser, in: A. Manz, H. Becker (Eds.)Microsystem Technology inChemistry and Life Sciences,Springer Verlag Berlin Heidelberg(1998) 51-82[5] S. Halstenberg, H. Eggert, A. Quinte,K.-P. Scherer,Sensor 2001 10th Int. Conf.,Nürnberg, Germany[6] P. Ehrhard, G. Janssens-Maenhout, I. Meisel, Thomas Schulenberg, diese Nachrichten[7] J. M. Wilkinson, Microm. Dev. 4 (3/1999) 1-3Literatur

Die Vision des schrumpfenden Labors: Mikrofluidische Lösungen für analytische Anwendungen in den Life Sciences

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