Moss, D.

Pepperkok, R.

KITopen

Nachdem die Infrarot-Spektro-skopie sich erfolgreich als Metho-de für strukturelle Untersuchun-gen von biologischen Molekülenetabliert hat, richtete in den ver-gangenen Jahren die Gemeindeder Biospektroskopiker ihr Au-genmerk auf die Erforschung vonZellen und Geweben. Hierbei istder Ansatz wie folgt: Mit der Infra-rotspektroskopie lassen sich sämt-liche chemischen Verbindungensichtbar machen, daher muss dasInfrarotspektrum eines sehr kom-plexen chemischen Systems wieeine biologische Zelle eine Sum-menfunktion der zellulären Che-mie darstellen. Dabei sind Unter-schiede im Verhalten, Zustand,Gesundheit bzw. Krankheit beiZellen und Geweben grundsätzlichimmer auf Unterschiede der zel-lulären Chemie zurückzuführen.Demzufolge müssen solche phy-siologisch und klinisch wichtigeUnterschiede durch Vergleiche der jeweiligen Infrarotspektren er-kennbar sein. Selbstverständlich sind solchespektralen Unterschiede in den In-frarotspektren von Zellen sehr sub-til – im Großen und Ganzen ist vonder Chemie her auch eine ster-bende oder an Krebs erkrankteZelle immer noch eine Zelle. Den-noch hat sich gezeigt, dass dieAuswertung der Spektren mit Hil-fe ausgeklügelter mathematischerMustererkennungs-Algorithmen zuviel versprechenden Ergebnissenführen kann. Diese Ergebnissedeuten auf weitreichende Anwen-dungsmöglichkeiten in der biolo-gischen Forschung sowie in denGebieten der Gewebeerkennung,Diagnose von Krankheiten undKlassifizierung von Bakterien-stämmen hin [1,2]. Das Synchrotron als Infrarotlicht-quelle ist für solche Messungengeradezu ideal, da sie eine räum-liche Auflösung bietet, die dieMessung einzelner Zellen ermög-licht. Bei Messungen mit her-kömmlichen Laborgeräten wirdtypischerweise ein Messfleck von100 bis 200 µm benötigt, umgenügend Licht für die spektro-skopischen Messungen durch diebiologische Probe zu kriegen. Sowerden viele Zellen gleichzeitiggemessen und das erhalteneSpektrum stellt den Durchschnittüber alle Zellen dar. Das hat aberden Nachteil, dass bei einer he-terogenen Population der Durch-schnitt allein ein sehr verzerrtesBild wiedergeben kann, weil diebiologisch wichtigen intra-indivu-ellen Unterschiede untergehen(statistisch gesehen hat ja derDurchschnittmensch eine Hodeund eine Brust!). Am Synchrotron,dank seiner effektiven Lichtquel-lengröße im Mikrometerbereichund Strahldivergenz von wenigerals 1°, kann das Infrarotlicht ver-lustfrei auf eine 5 µm große Pro-benfläche fokussiert werden. Dieerreichbare Lichtintensität auf ei-nem solch minimalen Messfleckist bis zu 1000 mal höher als miteinem herkömmlichen Laborgerätund liefert Spektren mit hervorra-gendem Signal-Rausch-Verhält-nis bei Messzeiten im Sekunden-bereich [3]. Über Infrarotmessungen von ein-zelnen Zellen mit Synchrotronlichtwurde bereits berichtet, z.B. anden U.S.-amerikanischen Syn-chrotrons ALS in Kalifornien [4]und NSLS in New York [5]. Aller-dings handelte es sich hierbei –wie auch bei bisherigen Messun-gen mit herkömmlichen Labor-geräten – um getrocknetes bzw. fi-xiertes Probenmaterial. Ziel unse-rer Studie an ANKA war es, einebiologisch relevantere Infrarot-Messmethode für einzelne leben-de Zellen zu entwickeln. Das be-deutet, die Zellen müssen sichauch während der Messung inwässrigem Kulturmedium befin-den und durch dieses Wasser hin-durch muss spektroskopiert wer-den. Wegen der starken Hinter-grundsabsorption des Wassers imInfrarotbereich ist dies zwar einegroße experimentelle Herausfor-derung, die Vorteile sind aber klarersichtlich: Mögliche Artefakte wer-den vermieden und dadurch dieBedeutung für die biomedizinischeForschung gesichert, spektrale Än-derungen in Antwort auf Einflüssewie Drogen oder Umweltgifte kön-nen in Echtzeit verfolgt werdenund somit wird beim Vergleich ei-ner behandelten Zelle mit einer un-behandelten Kontrollzelle der po-tentielle Unsicherheitsfaktor derintra-individuellen Unterschiedeeliminiert. Wie bei der Methodeder Differenzspektroskopie für iso-lierte Biomoleküle [6-8] kann somiterreicht werden, dass subtile spek-trale Unterschiede mit größtmög-licher Sicherheit und Präzision er-fasst werden können.Die Experimente wurden am In-frarotmikroskop des StrahlrohrsANKA-IR durchgeführt (Abb. 1).Dieses Strahlrohr nutzt die Syn-chrotron-Kantenstrahlung, eineneue Methode um die Strahlung ei-nes relativistischen Elektronen-strahls von noch höherer Brillanz zuerhalten als dies von herkömmli-MessmethodenEinleitung241(241)Synchrotron-Infrarot-Mikrospektroskopie an lebenden ZellenD. Moss, ISS; M. Keese, Universitätsklinikum Mannheim; R. Pepperkok, European Molecular Biology Laboratory Heidelberg NACHRICHTEN - Forschungszentrum Karlsruhe  Jahrg. 37  4/2005  S. 241-246 sunden Zellen wurden sowohl inkonfluenten als auch nicht-konflu-enten Kulturen untersucht. Die Zell-kulturen wurden ca. 24 Stunden vorden Messungen auf 32 x 3 mmgroße CaF2-Fenster etabliert undbei 37°C inkubiert. Unmittelbar vorden Messungen wurden die in-zwischen mit gut haftenden Zell-kulturen belegten Fenster in einehandelsübliche zerlegbare Durch-flussküvette montiert. Mit Hilfe ei-nes Teflon-Abstandhalters wurdedie Schichtdicke der Küvette auf 11bis 12 µm eingestellt. Währendden Infrarotmessungen wurden dieZellen bei 35°C gehalten und miteinem kontinuierlichen, langsamenKulturmediumfluss versorgt (230 µlpro Stunde). Die Aufnahme einesInfrarotspektrums erfolgte durchBlenden von 20 bis 30 µm Durch-messer und dauerte ca. 30 Se-kunden.An dieser Stelle möchten wir an-merken, dass sich das Synchro-tron-Infrarotlicht weder toxischnoch erbgutschädigend auf le-bende Zellen auswirkt. Die Strah-lung verursacht auch keine Hitze-schäden, wie am ALS-Synchrotrondurchgeführte Experimente [10]belegt haben. Als Beweis für dieLebensfähigkeit der Zellen wäh-rend der hier berichteten Messun-gen kann man anmerken, dassZellbewegungen und -teilungenwährend der mehreren Stundenandauernden Experimente beob-achtet wurde.Erstes experimentelles Ziel war,die Reproduzierbarkeit von Mes-sungen unbehandelter Zellen übereinen längeren Zeitraum zu sichern.Ergebnisse undDiskussion242(242)Abb. 1: Experimenteller Messaufbau am ANKA-IR Strahlrohr. Oben(links nach rechts): FTIR-Spektralphotometer, Durchflusstempe-rierbad, Schlauchquetschpumpe für die Mediumversorgung, IR-Mi-kroskop. Unten: Nahaufnahme der IR-Durchflusskuvette am XY-Tisch des IR-Mikroskops. chen Synchrotronquellen erzieltwerden kann [9]. Es wurden verschiedene Arten vonmenschlichen Darmkrebszellen(HT29, SW-480, WIDR, CaCo2)sowie als gesunde Kontrollenmenschliche Fibroblasten (Primär-kulturen) und Endothelzellen ausmenschlichen Nabelschnurvenenuntersucht. Diese Krebs- und ge-Dazu wurden mit Hilfe des moto-risierten XY-Tisches am Infrarot-mikroskop je Kultur 10 verschie-dene Zellen wiederholt gemessen(siehe Abb. 2). Über eine Gesamt-zeit von 2 Stunden wurde jede Zel-le im 24-Minutentakt gemessen.Vor jeder dieser Messungen wur-de ein Referenzspektrum an ei-nem benachbarten zellfreien Be-reich aufgenommen, um die lang-same Intensitätsabnahme des Syn-chrotronstrahls zwischen den Elek-tronen-Injektionen zu kompensie-ren. Ein typisches Messergebnishierzu wird in Abb. 3 dargestellt. Als erstes sei auf die sehr hoheQualität der aufgenommenenSpektren hingewiesen, welchetrotz der starken Hintergrundsab-sorption des Wassers erreicht wer-den konnte. Die erhaltenen Spek-tren sind in guter Übereinstimmungmit den vielen publizierten Spek-tren von Zellen und Geweben undzeigen die typischen Absorptions-banden, die den Proteinen, Nu-kleinsäuren und  Lipiden zugeord-net werden können.Die Daten zeigen sehr anschaulich,welch gute Reproduzierbarkeit mitdiesem Experimentaufbau erzieltwerden konnte. Es traten deutlicheintra-individuelle Unterschiede zwi-schen den Zellen auf, die deutlichgrößer als die Standardabwei-chungen für die wiederholte Mes-sungen an einer einzelnen Zellesind. Dies bestätigt auch, dass diePositionierung auf der XY-Platt-form des Bruker IR-Mikroskops inhohem Maße reproduzierbar undwährend der mehrstündigen Dau-er des Experimentes auch die Po-sition des Synchrotronstrahls aus-reichend stabil war. In weitergehenden Experimentenwurde detailliert auf die oben er-wähnten intra-individuellen Unter-schiede eingegangen. In mehrerenunabhängigen Kulturen von jedemZelltyp wurden Spektren der ein-zelnen Zellen in Gruppen von 50aufgenommen. Auch hier wurdedas Verfahren angewandt, Refe-renzspektren von benachbarterzellfreier Lösung für jede Messungzu erstellen. Als eine einfache Ana-lyse der Varianz innerhalb dieserDaten wurden die Ausschläge derAmid-II-Bande des Proteins (de-finiert als der vertikale Abstand zwischen dem Maximum bei 1545 cm-1 und dem Minimum bei1475 cm-1) in jedem Satz von Ein-zelzell-Spektren gemessen undgrafisch als Frequenz-Plot (Abb.4) dargestellt. Für die menschlichen Darmkrebs-zelllinien HT29, CaCo2 und SW-480 erschien die Verteilung derAmid-II-Intensität mit einer sehrschmalen normalen Verteilung alsbeständig. Diese Beobachtunglässt den Schluss zu, dass hier derMittelwert alleine genügen würde,um diese Populationen zu be-schreiben. Jedoch zeigte die Amid-II-Intensität bei dem WIDR-Zellty-pus klare Hinweise, dass mindes-tens zwei verschiedene Popula-tionen vorhanden waren. Hätteman sich bei diesen Messungenausschließlich auf eine Mittelung243(243)Abb. 2: Zellkultur (hier: Konfluente Kultur von menschlichen Fibroblasten)durch das IR-Mikroskop gesehen. Die Gesamtbildgröße entspricht 280 x210 µm. Die mit ‚M’ gekennzeichnete Kreuze stellen die ausgewählten Mess-positionen dar. Zehn dieser Positionen sind mehrfach ausgewählt, um die je-weils betroffene Zelle wiederholt zu messen. Am linken Bildrand sieht man dieausgewählten Referenzmesspositionen im benachbarten zellfreien Bereich.  244(244)Abb. 3: Reproduzierbarkeit von wiederholten Messungen der Infrarotspektren von einzelnen leben-den menschlichen Fibroblasten. Mit Hilfe des motorisierten XY-Tisches des IR-Mikroskops wurden10 verschiedene Zellen in konfluenter Kultur wiederholt in den IR-Strahl gebracht und gemessen. Eine Blende mit 30 µm Durchmesser wurde verwendet, um den Messstrahl auf eine Zelle einzuschränken.Jedes Diagramm zeigt den Mittelwert (blau) ± Standardabweichung (rot) für eine Zelle.0,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050–0,05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 30000,250,20,150,10,050– 05Absorption1000 1500 2000Wellenzahl [cm–1]2500 3000der Messung verlassen, um eineMustererkennungs-Software zutrainieren, hätte dies sehr leicht zuirreführenden Ergebnissen führenkönnen. Bei diesem Beispiel wärenalso die Messungen von einzel-nen Zellen für die Charakterisierungder Zellpopulation und der verläss-lichen Unterscheidung von ande-ren Zelltypen essentiell notwen-dig.Wie bereits eingangs erwähnt, galtals ein vorrangiges Interesse derAutoren die Möglichkeit, spektra-le Änderungen von einzelnen Zel-len in Antwort auf entsprechendeStimuli in Echtzeit aufzunehmen.Die hier gezeigten Daten bestätigendie Durchführbarkeit solcher Ex-perimente und zeigen, dass relativkleine spektrale Änderungen überlängere Zeiträume (mehrere Stun-den) erfasst werden können. In An-sätzen wurden bereits solche Ex-perimente durchgeführt, z.B. mitH2O2 als direktes Oxidationsmittelder Protein-Sulfhydrylgruppe wieauch mit dem Phosphatase-Inhi-bitor Vanadat. Spektrale Verände-rungen konnten beobachtet wer-den, die aber noch auf Reprodu-zierbarkeit und Gültigkeit hin aus-gewertet werden müssen. Die Er-gebnisse werden in einer zukünf-tigen Veröffentlichung vorgestelltwerden.Die von uns erhaltenen Daten be-legen die Möglichkeit, Infrarot-spektren von einzelnen lebendenZellen in wässrigem Kulturmediummit guter Präzision und Reprodu-zierbarkeit aufzunehmen. Dabeihandelte es sich vorerst lediglichum eine Machbarkeitsstudie, diedennoch bei der Vorstellung ge-genüber der internationalen Bio-spektroskopie-Gemeinde  [11-14]auf eine erfreulich reges Interessegestoßen ist. Der Ansatz ist auch zeitgemäß.Seit mehr als einem Jahrhunderthaben Biologen die PhysiologieSchlussfolgerung245(245)Abb. 4: Intra-individuelle Varianz in den Infrarotspektren von Darmkrebszellen. Eine Blende mit 20 µmDurchmesser wurde verwendet, um den Messstrahl auf eine Zelle einzuschränken. Je 50 Messun-gen an Einzelzellen wurden durchgeführt. Aufgetragen wird die Verteilung der Intensität der Amid-II-Bande. Oben links, HT29-Zellen; oben rechts, CaCo2-Zellen; unten links, SW-480-Zellen; untenrechts, WIDR-Zellen.3530252015Häufigkeit10500 0,05 0,1Amid-II-Intensität0,15 0,23530252015Häufigkeit10500 0,05 0,1Amid-II-Intensität0,15 0,23530252015Häufigkeit10500 0,05 0,1Amid-II-Intensität0,15 0,212108642Häufigkeit00 0,05 0,1Amid-II-Intensität0,15 0,2von  Organismen, Organen undZellen erforscht und versucht, die-se Systeme in ihrer Gesamtheit zuverstehen, während Biochemikerdie einzelnen biologischen Mo-leküle in gereinigter Form studier-ten und daraus ein Verständnisvon Lebensprozessen syntheti-sieren wollten. Die Herausforde-rung für das 21. Jahrhundert wirdsein, diese zwei Vorgehensweisenzusammen zu bringen. Die hiervorgestellte Messmethode, die dieChemie in lebenden Zellen in Echt-zeit verfolgen lässt, könnte signi-fikant dazu beitragen.Zusammenfassend kann gesagtwerden, dass diese ersten Datenunserer noch anhaltenden Studieviel versprechend sind. Wir sindoptimistisch, dass dieser Ansatzein potentiell nützliches Werkzeugsowohl für die Forschung als auchfür die klinische Diagnostik dar-stellt.Der Autor, D. A. Moss, möchteProf. Max Diem und seinen Kolle-gen für die anregende Diskussionüber diese Ergebnisse danken –Danksagung246(246)[1] H.H. Mantsch, D. Chapman (Hrsg.), Infrared Spectroscopy ofBiomolecules, Wiley-Liss, Toronto,1996[2] J.M. Chalmers, P.R. Griffiths (Hrsg.), Handbook of VibrationalSpectroscopy, Vol. 5, John Wiley,Chichester, 2002[3] W.D. Duncan, G.P. Williams, Appl. Opt. 22 (1983) 2914.[4] H.-Y.N. Holman, R. Goth-Goldstein,M.C. Martin, M.L. Russell,W.R. McKinney, Env. Sci. Technol. 34 (2000) 2513 [5] L. Miller, P. Dumas, N. Jamin, J.L. Teillaud, J. Miklossi, L. Forro,  (2002) Rev. Sci. Instrum. 73, 13571[6] W. Mäntele, (1993) Trends Biochem. Sci. 18, 197[7] F. Siebert, (1995) Methods Enzymol. 246, 501[8] D.A. Moss, K. Füchsle, R. Masuch, A. Wolf, (2000) SPIE Proc. 3918, 97[9] Y-L., Mathis, P. Roy, B. Tremblay, A. Nucara, S. Lupi, P. Calvani, A. Gerschel, (1998) Phys. Rev. Lett. 80, 1220[10] H.-Y.N. Holman, M.C. Martin, W.R. McKinney, (2003) J. Biol. Phys. 29, 275[11] M. Keese, R. Pepperkok, D.A. Moss, (2003) 1st Workshop on BiologicalApplications of Synchrotron Infraredin Europe, Karlsruhe, 11.-12. September 2003 [12] D.A. Moss, M. Keese, R. Pepperkok, (2004) 3rd International Conference‘Shedding New Light on Disease’,Newark, U.S.A., 19.-24. Juni 2004 [13] D.A. Moss, M. Keese, R. Pepperkok, (2004) FTIR Spectroscopy inMicrobiological and MedicalDiagnostics, Berlin, 21.-22. Oktober 2004 [14] D.A. Moss, M. Keese, R. Pepperkok, (2005) Vib. Spectrosc. 38, 185Literaturwie auch seinen Teamkollegen Dr. Yves-Laurent Mathis und Dr.Biliana Gasharova für ihre sehrwertvolle Zusammenarbeit bei derEntwicklung der IR-Mikroskopie-Messstation an ANKA. Ebenfallsherzlichen Dank an Frau AnnetteBöttcher / IMK-ASF für die fach-gerechte Übersetzung der engli-schen Vorlage.

Synchrotron-Infrarot-Mikrospektroskopie an lebenden Zellen

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