Huettermann, J.

Mueller, A.

KITopen

November 1968jApril 1969Institut für StrahlenbiologieKFKRadical Formation in Cysteamine Free Base and Cystamine • lHCl byReaction with Atomic Hydrogen and by Gam.ma-IrradiationW c Freyland. Ac MüllerElektronen-Spin-Resonanz an Y-bestrahlten Einkristallen von2-Desoxy-D- RiboseJ. Hüttermann. A. MüllerHUNGM.B.H.INT. J. RADIAT. BIOL., VOL. 14, NO. 5, 483-485CORRESPONDENCERadical formation in cysteamine free base andcystamine . 2HCI by reaction with atomic hydrogen andby gamma-irradiationWERNER FREYLAND and ADOLF MÜLLERInstitut für Strahlenbiologie, Kernforschungszentrum Karlsruhe, Germany(Received 20 August 1968; revision received 20 September 1968)Sulphhydryl and disulphide compounds are known for their radioprotectiveeffect on elementary biological systems, such as proteins and battetiophage.HQwever, basie problems cÖllceriiing the detailed mechanism of the protectiveaction remain unsolved. Rationalization of the existing experimental evidencehas been attempted repeatedly and by various authors. One of the resultinghypotheses, proposed by Braams (1963), links the protective action to theability of the compounds considered to scavenge small radiation-producedradicals, especially hydrogen atoms. To learn more about such reactions in thedry state, where protection has been shown to occur, as well as in aqueoussolution, we have compared electron spin resonance spectra of radicals producedin polycrystalline protective compounds by gamma-radiation and by interactionwith atomic hydrogen generated directly in agas discharge.Cysteamine was obtained as a free base from Fluka, Switzerland,cystamine . 2HCl from various sources (Fluka; Nutritional Biochemicals;Calbiochem). The substances were prepared for our investigations either bylyophilization or by sublimation in vacuo. Both methods reduced the averagecrystal size of the material considerably, entailing a corresponding increase ofaccessible surface area. Atomic hydrogen was generated within a glass tubeusing an electrodeless discharge at 30 kHz frequency. Great care was taken toavoid a possible contribution oE u.v.-light from the discharge to the radi<;alproduction. The experiments were performed at room temperature and at ahydrogen pressure of about 15 torr. Exposure times varied between 15 and120 min. After reaction with atomic hydrogen sampies were evacuated andsealed. The experimental arrangement used was a modified version of thatdescribed by Jung and Kürzinger (1968).Gamma-irradiations were performed in a 60Co-source at a dose-rate oE1·25 Mrads per hour. Several measurements were done after irradiation ofsampies with u.v.-light of 253·7 nm wave-length. For E.S.R. measurements aspectrometer working at 9·3 GHz (AEG) was used. A crystal of diphenyl-picrylhydrazyl was employed for calihration of the g-factor at a value of 2·0036.Several spectra were recorded with a second E.S.R. spectrometer at 34-5 GHz inorder to detect variations of spectra with magnetic field strength.First derivative E.S.R. spectra of H-exposed cysteamine and cystamine . 2HClare represented in figure 1. The centre of the cysteamine spectrum (figure 1 (a))is characterized by a g-factor oE 2·034. This high value already indicates thestabilization oE the radical electron at the sulphur atom. The g-factors484 Correspondencecorresponding to the extreme left maximum, the base-line crossing, and theextreme right minimum, represent the three principal elements of the g-tensor(Kneubühl1960). The numerical values determined on this basis: gl=2·047,g2=2·029, g3=2·002, are in good agreement with results obtained after gamma~irradiation of single crystals of cystine . 2HCl by Kurita and Gordy (1961) andof polycrystalline cysteine, cysteamine. HCl and penicillamine by Henriksen(1962). Supported by this. evidence, the predominant production of the radical(a) (b)Figure 1. First derivative E.S.R. spectrum 01 dry, powdered cysteamine free base (a) andcystamine. 2HCl (b) at 9'3 GHz after exposure to discharge-produced atomichydrogen.RS', when cysteamine is exposed to atomic hydrogen, is concluded. However,the observed E.S.R. spectrum only partially resembles the typical sulphurpattern due to the superposition of additional hyperfine lines originating pre-sumably from a second radical. For the same reason, any possible hyperfineinteraction from non-sulphur atoms of the sulphur radical cannot be resolved.Of the diverse mechanisms of the protective action that have been advanced,this result has the most direct bearing on the reaction:RSH+H'-+RS'+H2 ,proposed by Braams (1963) as the crucial protective process of sulphhydrylcompounds RSH. The E.S.R. spectrum of the H-exposed cystamine. 2HClshown in figure 1 (b) is composed of at least two parts: a quintet centred atg=2'003 with a mean splitting of 26 Oe and a sulphur pattern appearing at 10wmagnetic-field strength. The latter is assumed to originate from the reaction:RSSR + H' -+RSH + RS' ,while the quintet is attributed to an unknown non-sulphur radical.For comparison, we also recorded E.S.R. spectra following gamma- or V.V.-irradiation. Cystamine. 2HCl yielded a sulphur pattern with both types ofradiation. The v.v.-induced spectrum shows an absorption line on the high-fieldside which cannot be seen after H-exposure. This fact demonstrates that v.v.does not contribute appreciably to the latter. A sulphur spectrum is also foundafter absorption of v;v.-light by cysteamine free base indicating production ofCorrespondence 4-85RS·-radicals. Contrary to expectation this spectral component is completelyabsent after gamma-irradiation. In this case an E. S.R. spectrum is recorded whichhas not been reported previously. It is shown in figure 2 at E.S. R. frequencies of9·3 and 34-·5 GHz. In both parts of figure 2, a triplet spectrum with intensityratios of 1 : 2 : 1, a mean g-factor of 2·0055, and a hyperfine splitting of 25 Oe isprominent. These data are closely analogous to those obtained with N'H2(Foner, Cochran, Bowers and Jen 1958, AI-Naimy, Moorthy and Weiss 1966),g=2·0035(a)20 G>----<(0)Figure 2. First derivative E.S.R. spectrum of gamma-irradiated cysteamine free base atmicrowave frequencies of 9·3 GHz (a) and 34'5 GHz (b). SampIes were irradiatedin vaeua and measured at 300oK.suggesting the presence of such radicals. The triplet is superimposed on asecond spectral component of slightly different g-factor, which may be seenat both frequencies but is more conspicuous at 9·3 GHz in figure 2 (a). This isprobably due to the presence of a second type of radical which has not beenidentified. However, the g-factor of both spectra are sufficiently elose to thefree electron value to ex~lude sulphur radicals. Since H-atoms give rise to asulphur pattern as has been shown above it is concluded that the production ofatomic hydrogen by gamma-radiation is not an effective process. Apparentlyrupture of moleeules into larger fragments is favoured which may weIl be due tothe large amounts of energy deposited by gamma-radiation. This view issupported by our observation that RS'-radicals are found not only after exposureto H-atoms but also after irradiation with u.v.-light.REFERENCESAL-N.,UlVIY, B. S., MOORTHY, P. N., and WEISS, J. ]., 1966, J. phys. Chem., Ithaea, 70, 3654.BRAAMS, R., 1963, Nature, Land., 200, 752.FONER, S. N., COCHRAN, E. L., BOWERS, V. A., andJEN, C. K., 1958, Phys. Rev. Lett., 1,91.HENRIKSEN, T., 1962, J. ehern. Phys., 37, 2189.JUNG, H., and KÜRZINGER, K., 1968, Radiat. Res. (in the press).KNEuBüHL, F. K., 1960, J. ehem. Phys., 33, 1074.KURITA, Y., and GORDY, W., 1961, J. ehem. Phys., 34, 282.Sonderabdruck aus der ZEITSCHRIFT FüR NATURFORSCHUNG Band 24 b, Heft 4, 1969Verlag der Zeitschrift für Naturforschung, TübingenElektronen-Spin-Resonanz an y-hestrahltenEinkristallen von 2.Desoxy-D-Rihose1 J. HÜTTERMANN u. A. MÜLLER, Radiat. Res. 37 [1969], imDruck. .2 S. S. JACOBS, Thesis, University of Colorado (1962).Abb. 1. ESR-Spektrum (1. Ableitung) eines bestrahlten Des-oxyribose-Einkristalls. Das Magnetfeld H liegt parallel zurab-Ebene. Die Balken unter dem Spektrum geben die theore"tischen Linienpositionen und -amplituden des vorherrschendenRadikals an.I----l206aussH-möglich unter der Annahme einer strahleninduziertenUmordnung von Atomen in der Desoxyribose. UnterBerücksichtigung der Befunde aus dery-Radiolyse vonKohlehydraten im festen Zustand 2 nehmen wir dieDissoziation eines H-Atoms von der Pentose an. DerPyranosering, den die Desoxyribose in den von unsbenutzten Einkristallen bildet, geht dann durch intra-molekularen Wasserstofftransfer bei simultanem Ring-bruch entsprechend dem folgenden SchemaJÜRGEN HÜTTERMANN und Adolf MÜLLERInstitut für Strahlenbiologie, Kernforschungszentrum,Karlsruhe(Z. Naturforschg. 24 b, 463-464 [1969] ; eingeg. am 16. November 1968)Wir haben durch ionisierende Strahlung im DNS-Zucker, 2-Desoxy-D-Ribose; erzeugtesfäbile lreie Radl~kaIe mit Hilfe der Elektronen-Spin-Resonanz(ESR)-Methode untersucht. Hierzu wurden Einkristalle derSubstanz, welche aus Acetonlösungen gezüchtet wurden,bei 300 °K in einer 6oCo-Quelle bis zu Dosen von 0,4Mrad bestrahlt und in einem konventionellen Spektro-meter (AEG) gemessen. Die verwendete Mikrowellen-frequenz lag bei 35 GHz (Q-Band). Durch Drehungder Kristalle im Magnetfeld um drei zueinander senk-rechte Achsen wurde die Winkelabhängigkeit desg-Faktors und der Hyperfeinstruktur der Radikaleregistriert. Diese Methode ermöglicht oft eine eindeu-tige Identifizierung der den Spektren zugrunde liegen-den Radikalstrukturen.In der Abb. 1 wird ein Spektrum gezeigt, bei demdas Magnetfeld H parallel zur ab-Ebene des Kristallsliegt. In diesem Fall besteht das Spektrum im wesent-lichen aus fünf Linien mit einer Aufspaltung von etwa10,5 Gauss und einem Amplitudenverhältnis der Linienvon etwa 1:4:6:4:1, wie es durch die Balken unterdem Spektrum angezeigt wird. Bei Drehung des Kri-stalls im Magnetfeld erweist sich diese Liniengruppehinsichtlich ihres g-Faktors und des Linienabstandesals nahezu isotrop mit mittleren Werten von 2,005 fürden g-Faktor und 10,5 Gauss für die Hyperfein-Auf-spaltung.Neben dieser Quintettgruppe wurden in den Spek-tren weitere, weniger intensive Linien beobachtet, vondenen eine am rechten Ende des Spektrums in Abb. 1zu sehen ist. Die zu diesen Linien gehörenden Radikal-strukturen konnten bislang noch nicht aufgeklärt wer-q.en. Unsere Untersuchungen deuten jedoch darauf hin,daß Linien mindestens zweier weiterer Radikale in den$pektren vorliegen, wie in einer anderen Arbeit aus-flihrlich diskutiert wird 1.Aus den obigen Daten für das Quintett-Spektrumwird geschlossen, daß ein Kohlenstoffradikal vorliegt,dessen Hyperfeinstruktur durch Wechselwirkung desRadlkalelektrons mit vier äquivalenten Protonen inß.:Po§itiQ:Il, verursacht wird. Diese Konfiguration ist nur464in das dargestellte Radikal über. Diese Annahmen wer-den gestützt durch Infrarotspektren bestrahlter festerDesoxyribose, welche gegenüber den unbestrahlten Kon-trollen eine starke Absorptionsbande bei etwa 1730cm-1 aufweisen, die von C= O-Schwingungen herrührt.Dieses Ergebnis unserer Untersuchungen kann viel-leicht einen Beitrag zur Aufklärung der Bedeutung derDesoxyribose bei der Wirkung ionisierender Strahlungauf DNS liefern. Hierbei soll zwischen einer direktenund einer mehr indirekten Rolle des Zuckers unter-schieden werden. Letztere ergibt sich aus der Tatsache,daß die in Einkristallen von Nucleosiden nach Bestrah-lung beobachteten Radikale fast ausschließlich durchWasserstoffanlagerung an die jeweiligen Basen gebil-det werden, obwohl aus quantitativen Untersuchungenbekannt ist, daß die Radikalausbeuten der freien Pen-tosen weitaus größer sind, als die der Basen. Hierauswurde auf einen Energietransfer vom Zucker zur Basegeschlossen, der später durch ESR-Untersuchungen anbestrahlten molekularen Mischungen von Base undZucker als Transfer von atomarem Wasserstoff gedeutetwerden konnte. Die Fähigkeit atomaren Wasserstoffszur Reaktion mit organischen Molekülen oder zur Schä-3 J. HERAK u. W. GORDY, Proc. nato Acad. Sei. USA 54, 1287[1965] .digung biologisch aktiver Objekte konnte auf direk-tem Wege in verschiedenen Arbeiten gezeigt werden 3,4.Das in unseren Untersuchungen an Einkristallen reinerDesoxyribose gefundene Radikal stützt die Hypothesedes Wasserstofftransfers, da es ein direktes Folgepro-dukt der Dissoziation eines Wasserstoffatoms vom Pyra-nosering ist. Der so freigesetzte Wasserstoff könntedurch Diffusion an die Basen zu den beobachteten An-lagerungsradikalen führen.Die Frage nach einer direkten Verknüpfung des beiZimmertemperatur in bestrahlter Desoxyribose vor-herrschenden Radikals mit dem Strahlenschaden derDNS kann natürlich nicht in einfacher Weise beantwor-tet werden. Es liegt jedoch nahe, anzunehmen, daß alsFolgereaktion, etwa bei Auflösen bestrahlten Zuckersin Wasser, eine Fragmentierung des Moleküls erfolgt.Diese Annahme wird durch strahlenchernische Befundegestützt 2. Man kann daraus folgern, daß das hier ge-fundene Radikal als Vorstufe von Brüchen in der Poly-nucleotidkette der DNS angesehen werden kann, dieeilleIlsellrbedellttln~enAnteil an der biologischenStrahlenschädigung haben.·· ._--.4 H. JUNG u. K. KÜRZINGER, Radiat. Res. 36 [1968], imDruck.

Elektronen-Spin-Resonanz an γ-bestrahlten Einkristallen von 2-Desoxy-D-Ribose

https://publikationen.bibliothek.kit.edu/270002214/3809976

Elektronen-Spin-Resonanz an γ-bestrahlten Einkristallen von 2-Desoxy-D-Ribose

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

KITopen