Targeting neuronal populations by AAV-mediated gene transfer for studying the endocannabinoid system

Abstract

The cannabinoid type 1 (CB1) receptor is involved in a plethora of physiological functions and heterogeneously expressed on different neuronal populations. Several conditional loss-of-function studies revealed distinct effects of CB1 receptor signaling on glutamatergic and GABAergic neurons, respectively. To gain a comprehensive picture of CB1 receptor-mediated effects, the present study aimed at developing a gain-of-function approach, which complements conditional loss-of-function studies. Therefore, adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery and Cre-mediated recombination were combined to recreate an innovative method, which ensures region- and cell type-specific transgene expression in the brain. This method was used to overexpress the CB1 receptor in glutamatergic pyramidal neurons of the mouse hippocampus. Enhanced CB1 receptor activity at glutamatergic terminals caused impairment in hippocampus-dependent memory performance. On the other hand, elevated CB1 receptor levels provoked an increased protection against kainic acid-induced seizures and against excitotoxic neuronal cell death. This finding indicates the protective role of CB1 receptor on hippocampal glutamatergic terminals as a molecular stout guard in controlling excessive neuronal network activity. Hence, CB1 receptor on glutamatergic hippocampal neurons may represent a target for novel agents to restrain excitotoxic events and to treat neurodegenerative diseases. Endocannabinoid synthesizing and degrading enzymes tightly regulate endocannabinoid signaling, and thus, represent a promising therapeutic target. To further elucidate the precise function of the 2-AG degrading enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL), MAGL was overexpressed specifically in hippocampal pyramidal neurons. This genetic modification resulted in highly increased MAGL activity accompanied by a 50 % decrease in 2-AG levels without affecting the content of arachidonic acid and anandamide. Elevated MAGL protein levels at glutamatergic terminals eliminated depolarization-induced suppression of excitation (DSE), while depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) was unchanged. This result indicates that the on-demand availability of the endocannabinoid 2-AG is crucial for short-term plasticity at glutamatergic synapses in the hippocampus. Mice overexpressing MAGL exhibited elevated corticosterone levels under basal conditions and an increase in anxiety-like behavior, but surprisingly, showed no changes in aversive memory formation and in seizure susceptibility. This finding suggests that 2 AG-mediated hippocampal DSE is essential for adapting to aversive situations, but is not required to form aversive memory and to protect against kainic acid-induced seizures. Thus, specific inhibition of MAGL expressed in hippocampal pyramidal neurons may represent a potential treatment strategy for anxiety and stress disorders. Finally, the method of AAV-mediated cell type-specific transgene expression was advanced to allow drug-inducible and reversible transgene expression. Therefore, elements of the tetracycline-controlled gene expression system were incorporated in our “conditional” AAV vector. This approach showed that transgene expression is switched on after drug application and that background activity in the uninduced state was only detectable in scattered cells of the hippocampus. Thus, this AAV vector will proof useful for future research applications and gene therapy approaches.Der Cannabinoid Typ 1 (CB1) Rezeptor ist an einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt und heterogen in verschiedenen neuronalen Populationen exprimiert. Die unterschiedlichen Auswirkungen der CB1 Rezeptoraktivierung in glutamatergen bzw. GABAergen Neuronen wurden in verschiedenen Studien an Zelltyp-spezifischen CB1 Rezeptor-Knockout-Mäusen gezeigt. Um ein umfassendes Bild der CB1 Rezeptor-vermittelten Effekte zu gewinnen, wurde in dieser Studie ein Mausmodell entwickelt, das eine Zelltyp-spezifische Erhöhung der CB1 Rezeptorexpression aufweist und Zelltyp-spezifische CB1 Rezeptor-Knockout-Modelle komplementieren soll. Hierfür wurde eine innovative Methode durch Kombination von Adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermitteltem Gentransfer und Cre-vermittelter Rekombination entwickelt, die Hirnregion- und Zelltyp-spezifische Transgenexpression gewährleistet. Mithilfe dieser Methode konnte eine Überexpression des CB1 Rezeptors in glutamatergen Pyramidenneuronen des Hippocampus der Maus erzeugt werden. Es wurde gezeigt, dass eine Steigerung der CB1 Rezeptoraktivität in glutamatergen Neuronen zu einer Beeinträchtigung der Hippocampus-abhängigen Gedächtnisleistung führte. Andererseits schützten erhöhte CB1 Rezeptormengen vor Kainat-induzierten epileptischen Krampfanfällen und vor excitotoxischem Zelltod. Diese Erkenntnis deutet an, dass der CB1 Rezeptor in glutamatergen Neuronen eine protektive Funktion vor übermäßiger Netzwerkaktivität einnimmt und somit einen Ansatzpunkt für die Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen darstellt. Endocannabinoid-synthetisierende und -degradierende Enzyme regulieren das Ausmaß der Endocannabinoid-vermittelten Rezeptoraktivierung und stellen dadurch einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt dar. Um die exakte Funktion des 2-AG-degradierenden Enzyms Monoacylglycerol-Lipase (MAGL) weiter aufzuklären, wurde MAGL spezifisch in hippocampalen Pyramidenneuronen überexprimiert. Diese genetische Modifikation führte zu einer gesteigerten MAGL-Aktivität und zu einer Reduzierung von 2 AG um 50 % ohne den Gehalt an Arachidonsäure und Anandamid zu beeinflussen. Erhöhte MAGL Mengen in glutamatergen Neuronen unterbanden die synaptische Depression der Glutamatausschüttung, genannt „depolarization-induced suppression of excitation” (DSE), während die synaptische Depression der GABA-Ausschüttung, genannt „depolarization-induced suppression of inhibition“ (DSI), unverändert war. Dieses Ergebnis deutet an, dass die Verfügbarkeit des Endocannabinoids 2-AG entscheidend für die Kurzzeitdepression an glutamatergen Synapsen im Hippocampus ist. MAGL-überexprimierende Mäuse wiesen erhöhte Werte des Stresshormons Corticosteron unter Basalbedingungen auf und zeigten erhöhtes Angstverhalten. Überraschenderweise hatte die MAGL-Überexpression keinen Einfluss auf die Bildung eines aversiven Gedächtnisses und auf die Anfälligkeit für Krampfanfälle. Die gewonnen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass 2-AG-vermitteltes hippocampales DSE für eine Adaptierung auf eine aversive Situation erforderlich ist, aber nicht für die Bildung eines aversiven Gedächtnisses und die Protektion vor Kainat-induzierten Krampfanfällen benötigt wird. Folglich könnte eine spezifische Inhibition von MAGL in hippocampalen Pyramidenneuronen eine potentielle Behandlungsstrategie für Angst- und Belastungsstörungen darstellen. Schließlich wurde die Methode der AAV-vermittelten Zelltyp-spezifischen Transgenexpression weiterentwickelt, um eine Pharmakon-induzierbare und reversible Transgenexpression zu ermöglichen. Hierfür wurden Elemente des Tetracyclin-induzierbaren Genexpressionssystems in unseren „konditionalen“ AAV Vektor integriert. Dieser Ansatz zeigte, dass die Transgenexpression nach Gabe des Tetracyclin-Analogons Doxycyclin angeschaltet werden kann, und dass unspezifische Hintergrundexpression in Abwesenheit von Doxycyclin nur in vereinzelten Zellen des Hippocampus nachgewiesen werden konnte. Dieser AAV Vektor wird sich für künftige Forschungsansätze und Gentherapiestudien als nützlich erweisen