Generierung und Charakterisierung von in-vitro- und in- vivo-Modellsystemen zur Untersuchung des Skelettsystems

Abstract

Die Entstehung und Aufrechterhaltung von Knorpel- und Knochengewebe wird durch eine Vielzahl von hemmenden oder fördernden Faktoren hoch komplex reguliert, wobei die dabei involvierten physiologischen Prozesse bisher nur teilweise verstanden werden. Auch die Ursachen sowohl degenerativer Erkrankungen, aber auch durch Mutationen im FGFR3-Gen verursachter Chondrodysplasien sind in ihrer Ätiopathogenese noch nicht vollständig erforscht. In dieser Arbeit wurden verschiedene experimentelle Ansätze verfolgt, die zur weiteren Aufklärung der Pathophysiologie zweier unterschiedlicher Skeletterkrankungen beitragen sollten.rnEin relevantes Charakteristikum der degenerativen Gelenkserkrankung Osteoarthrose ist der Verlust an Aggrekan, hauptverantwortlich verursacht durch die Aggrekanase ADAMTS5. Es wurde ein Tiermodell generiert, bei dem gezielt mittels des Tet-ON-Systems die Aggrekanase mAdamts-5 überexprimiert werden kann. Nach Konstruktherstellung und Generierung als auch Charakterisierung des in vitro-Modells wurde das Tiermodell hergestellt, um die Folgen der Überexpression im Hinblick auf einen verstärkten Aggrekanabbau im Knorpel der Mäuse zu analysieren. Nach initialer Charakterisierung auf Induzierbarkeit zeigte eine Gründerlinie eine induzierbare transgene mAdamts5-Expression. Die Überprüfung auf Knorpelspezifität zeigte, sowohl embryonal als auch im adulten Tier, dass sich der verwendete, zusammengesetzte Kollagen-Typ II Promotor wie der endogene verhielt und somit funktional war. Nach Doxyzyklininduktion wurde bei der optimalen Dosis von 1 mg/ml im Vergleich zum induzierten Wildtyp-Tier eine 15%ige Abnahme des Gesamt-Glykosamino-glykan(GAG)-Gehaltes und eine um 120% erhöhte GAG-Abgabe ins Medium detektiert, was eine verstärkte Spaltung von Aggrekan bedeutete. Die transgene Aggrekanase wurde überexprimiert und spaltete verstärkt Aggrekan. Da aufgrund der histologischen Untersuchungen jedoch keine Knorpelerosionen feststellbar waren, konnte im Umkehrschluss gefolgert werden, dass der Knorpel einen Verlust an Glykosaminoglykanen bis zu einer gewissen Grenze tolerieren kann. Mit dem generierten und charakterisierten Tiermodell konnte mit dem Verlust an GAG eine Osteoarthrose-ähnliche Situation simuliert werden, insbesondere im Hinblick auf frühe Stadien der Erkrankung, bei denen noch keine makroskopisch eindeutig sichtbare Knorpelerosionen vorliegen. rnIm zweiten Teil der Arbeit wurden Zellkulturexperimente zur weiteren Aufklärung FGFR3-regulierter Prozesse durchgeführt. Nach Generierung und Verifizierung der stabilen Zelllinien, die mittels des Tet-ON-Systems das FGFR3-Gen mit jeweils einer Chondrodysplasie-assoziierten Mutation (Achondroplasie-Mutation G380R, Thanatophore Dysplasie Typ II-Mutation K650E) induzierbar überexprimieren, wurden die Auswirkungen der zwei verschiedenen Mutationen anhand bereits beschriebener Signalwege untersucht. Über die Rekrutierung des ERK-Signalweges konnte bei beiden Zelllinien die Funktionalität nachgewiesen werden, wobei die Zelllinie mit der einen schwereren Phänotyp beim Menschen verursachenden TDII-Mutation eine stärkere Aktivierung zeigte. Bei der Aktivierung von STAT1 wies nur die TDII-Zelllinie eine Phosphorylierung auf, nicht jedoch die ACH-Zelllinie; dies deckte sich mit bereits publizierten Untersuchungen. Beide Kaskaden zeigten eine unterschiedliche Signalantwort aufgrund der verschiedenen Mutationen. Des Weiteren konnte eine unterschiedliche MMP13-Zielgenexpression nachgewiesen werden, wobei lediglich die ACH-Zelllinie eine erhöhte MMP13-Expression (6-fach) zeigte. Zur Identifizierung neuer involvierter FGFR3-Zielgene wurde die differentielle Genexpression der TDII-Zelllinie im Vergleich induziert/nicht induziert mittels Microarray-Hybridisierung untersucht. Als interessantes Zielgen fiel STC1 auf, welches ebenfalls eine Rolle in der Chondrogenese spielt und bislang nicht mit FGFR3 in Verbindung gebracht wurde. Es konnte jedoch nur auf RNA-Ebene eine Regulation nachgewiesen werden. Nachfolgend durchgeführte transiente Experimente zeigten, dass die Wildtyp-Variante von FGFR3 möglicherweise eine Funktion in der Sekretion des Proteins STC1 hat und dass durch die beiden eingefügten Mutationen (ACH, TDII) diese aufgehoben ist. Der Einfluss von FGFR3 auf die Sekretion von STC1 stellt ein neues Ergebnis dar, insbesondere auch die Auswirkungen der beiden für die unterschiedlichen Krankheitsbilder stehenden Mutationen. Welche Relevanz allerdings die STC1-Sekretion im Rahmen FGFR3-assoziierter Erkrankungen hat, kann nicht eindeutig beurteilt werden. Weitere Faktoren aus dem hoch komplexen Zusammenspiel während der Knorpel/Knochenentwicklung müssen untersucht werden, um eine definitive Einordnung zu ermöglichen.The development and maintenance of cartilage and bone is regulated due to a multitude of different constrain and enhance factors. The causes of degenerative diseases as well as chondrodysplasia raised through mutations in the FGFR3 gene are not completely investigated in their etiopathogenesis. In the present doctoral thesis two different strategies was pursued to contribute to the clarification of the pathophysiology of two different skeletal diseases.rnOsteoarthritis is characterized through the loss of aggrecan, mainly caused to the aggrecanase ADAMTS5. A transgenic mouse with inducible overexpression of this aggrecanase using the Tetracycline system was generated. Prior to the in vivo studies the functionality of the generated bifunctional expression construct has been tested in vitro. Treatment with Doxycycline of transiently as well as stable transfected chondrosarcoma cells resulted in overexpression of transgenic mAdamts5. Generation and initial characterization of the transgenic mouse revealed, that one out of four mouse lines showed a Dox-dependent regulation of the transgenic mAdamts5. Examination of the specificity of the composed collagen type II promoter used in the mouse revealed that the promoter was functional because he acted as the endogenous one (embryonal, adult). By induction of Doxycycline with 1 mg/ ml there was detected a 15% decrease of the total amounts of glycosaminoglycans (GAG) and 120 % increase of GAG release in the medium. The transgenic aggrecanase has been overexpressed and induced an enhanced cleavage of aggrecan. Based on the histological analyses there was no erosions of the cartilage, thus the converse argument was that the cartilage can tolerate the loss of glycosaminoglycans until a specific threshold. With the generated and characterized mouse model and the loss of GAG it was able to simulate an Osteoarthritis-like situation especially in view of earlier stages of disease, in which no macroscopically visual erosions of the cartilage occur.rnIn the second part of this work, cell culture experiments for further explanations of the FGFR3 regulated process has been performed. It has been generated and verified stable cell lines with Dox-dependent overexpression of two different variants of the FGFR3 gene (two chondrodysplasia associated mutations: achondroplasia (ACH) mutation G380R, thanatophoric dysplasia type II (TDII) mutation K650E). First, the effect of these two different mutations has been investigated by means of described signaling pathways downstream of FGFR3. The functionality of both cell lines could be demonstrated by recruiting the ERK signaling pathway, whereat the cell line with the TDII mutation, that caused a severe phenotype in humans as the ACH mutation, revealed a stronger activation. By activating STAT1 only the TDII cell line possessed a phosphorylation, the cell line with the ACH mutation did not. The findings regarding STAT1 activation has been corresponded with published studies. However, both pathways revealed different signal responses due to the two different mutations. Furthermore, investigation of the MMP13 gene expression revealed, that only the cell line with the ACH mutation showed a 6-fold increase of the MMP13 expression whereas the cell line with the TDII mutation did not. To identify further FGFR3 target genes, a microarray hybridization experiment has been performed with the TDII cell line (in contrast induced/ not induced). The gene STC1 could be identified, which is also involved in the chondrogenesis and has not been linked with FGFR3 so far. The regulation could only be demonstrated at the RNA level. Transient cell culture experiments revealed that the wild-type variant of FGFR3 has been likely an effect to the secretion of STC1. Through the two mutations (ACH, TDII) the secretion of STC1 was abrogated. The influence of FGFR3 to the secretion of STC1 was a new outcome, particularly also the effect of the two different mutations. However, the relevance of the secretion of STC1 in line of diseases caused by mutations in the FGFR3 gene cannot be clearly estimated. To enable a definitive grading, further factors of the complex interaction during the development of bone and cartilage must determine