Diese Arbeit erörtert die Enzyme-Familie der ω-Transaminasen (ω-TA), die eine stereoselektive Übertragung einer Stickstoffgruppe von einem Amino-Donor auf ein Akzeptor Molekül (mit Keton/Aldehyd-Funktion) katalysieren. ω-Transaminasen sind von großem Interesse für viele pharmazeutische Prozesse und Synthese-Strategien, da selbige es ermöglichen, stickstoffhaltige Wirkstoffe enantiomerenrein zu produzieren.
Die Dissertation, angefertigt im Rahmen des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten Projektes Molecular Interaction Engineering (MIE), beschäftigte sich hierbei mit der Enzymherstellung und Modifikation am Beispiel der Synthese von β-Aminosäuren sowie dem Abbau selbiger durch Mikroorganismen. Im Fokus dieser Arbeit stand daher die Transaminierung von β-Ketosäuren/estern, das dafür notwendige Enzym Engineering, sowie die Charakterisierung und Katalogisierung der ω-Transaminase-Familie. Das primäre Ziel war hierbei die Synthese des chiralen Paclitaxel-Bestandteils, β-Phenylalanine(ester), durch ω-Transaminasen demonstrieren.
Zusammenfassend konnten in dieser Thesis folgende Punkte erreicht werden:
o Die Proteinproduktion und Reinigung der ω-TA aus Variovorax paradoxus konnte durch Codon-Optimierung sowie Fast-protein-liquid-chromatography (FPLC) mittels Ni-NTA-Säulen verbessert werden und die Langzeitstabilität konnte erhöht werden.
o Außerdem konnte eine ω-Transaminase-Engineering-Datenbank (oTAED) als hilfreiche Basis für das Transaminase Engineering etabliert werden.
o Funktionelle Aminosäurepositionen in der V. paradoxus ω-TA wurden mutiert und die Auswirkungen auf die Aktivität untersucht.
o Durch gezielte Mutagenese konnte die Proteinstabilität der ω-TA aus V. paradoxus unter gleichzeitigem Erhalt der Aktivität verbessert werden.
o Es konnten die Schwierigkeiten bei der Synthese von β-Phenylalanin (β-PA) durch eine Lipase-ω-TA Kaskadenreaktion erörtert und gezeigt werden. Hierbei wurden alternative Syntheseweg vorgeschlagen und analysiert.
o Es wurden zwei ω-TA für die Synthese von (R)- sowie (S)-β-PA-Ethylester identifiziert durch Screening einer ω-TA Bibliothek.
o Eine ω-TA (namentlich 3FCR_4M) zeigte Potenzial für eine Maßstabsvergrößerung um den Faktor 200 für die Synthese des (S)-β-PA-Ethylester (200 mL - 30 mM Produktkonzentration).
o Der Abbau von β-PA durch zwei Bakterien konnte unter kontrollierten Bedingungen genauer analysiert werden. Dabei wurde erstmals der simultane Abbau beider Enantiomere einer β-Aminosäure durch ein Bakterium gezeigt, wobei neben der Transaminierung noch ein weiterer, bislang unbekannter Abbaumechanismus erfolgt
