学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 堅田 利明, 東京大学教授 一條 秀憲, 東京大学教授 富田 泰輔, 東京大学特任准教授 田口 友彦, 東京大学講師 前田 和哉University of Tokyo(東京大学

Shinohara Kentaro

篠原 健太朗

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A 
 
B 
図 1. 分泌経路と ER exit site の局在 
A. 細胞内における分泌タンパク質の分泌経路 
B. ER exit site の細胞内局在 (Sec16: ER exit site) 
 
 
 
論文の内容の要旨 
 
 
 
 論文題目  小胞体上の分泌タンパク質出芽部位 ER exit site の局在制御機構     
 
 
 
 
             氏名  篠原 健太朗 
      
 
 
 
 
 
 
 
【序論】 
 小胞体は細胞質全体に大きく広がった
膜構造を形成し、分泌タンパク質が合成
されるオルガネラである。合成された分
泌タンパク質は、小胞体上の特殊なドメ
インである ER exit site において COPII
被覆小胞に積み込まれて出芽し、ゴルジ
体を経て細胞外へと分泌される (図 1 A)。 
ER exit site は、哺乳動物の１細胞あ
たり数百個存在し、細胞質全体に広く分
布している。また、その細胞内局在には
特徴があり、核近傍側ではお互いに密集
して局在するのに対し、細胞質側では一
つ一つが離れて局在している (図１B)。 
図 2. 免疫染色法による ER exit site の局在評価 
A. 異なる pH値の DMEM で培養したときの 
ER exit site の局在変化 
B. 酸性側と塩基性側条件の DMEM で培養したときの 
ER exit site の可逆的局在変化 
A 
B 
細胞内の全ての ER exit site は、COPⅡ被覆小胞の出芽部位として同様に機能するものとして考えら
れていたが、核近傍側に密集した ER exit site は、巨大分子コラーゲンの分泌に必要であることを示
唆する知見が報告された。このことは、核近傍側の ER exit site と細胞質側の ER exit site との間
で機能や分泌動態に違いがあることを示唆している。また、小胞体からの輸送機構を解明するために
は、COPⅡ被覆小胞の形成や輸送に着目した解析だけでなく、ER exit site の細胞内局在に着目した解
析も重要であることを示唆するものである。しかしながら現在、ER exit site の細胞内局在に着目し
た知見は乏しく、核近傍側と細胞質側の ER exit site との間で機能や分泌動態に違いを生じさせる分
子機構は不明である。 
本研究では、細胞内の ER exit site を核近傍側に密集した群と細胞質側に点在した群とに分類し、
pH 変化に伴って ER exit site の局在が両群の間で大きく変化することを新たに見出した。さらに、こ
れを一つの手段として用いることで、それぞれの細胞内局在制御に関与する分子機構の解析を行った。 
 
 
【結果】 
1、 細胞培養液 DMEM の pH によって ER exit site の局在が可逆的に大きく変化する 
HeLa 細胞を異なる pHの培養液 DMEM で培養したところ、ER exit site の局在が大きく異なる様子が
観察された。中性条件 (pH= 7.4)では核近傍と細胞質全体に存在する ER exit site が、酸性条件  (pH= 
6.8)では核近傍の密集が消失し、細胞質全体に広く点在した。さらに、塩基性条件 (pH= 7.8) では主
に核近傍への密集のみが観察された (図 2 A)。次に、あらかじめ酸性条件で培養した後に、塩基性条
件で培養すると、細胞質全体に点在し
ていた ER exit site が核近傍に集積
する様子が認められた (図 2 B)。よっ
てこの現象が pH に依存して可逆的で
あることが明らかとなった。 
 
2、 ER exit site は小胞体膜上を移動
している 
次に本現象が小胞体膜上の変化を
伴っているか解析する目的で、ER exit 
site に局在する膜タンパク質である
Sec12 の局在を評価した。その結果、
Sec12 も DMEM の pH によって局在が大
きく変化する様子が観察された (図
3)。次に Nikon spinning disk 共焦点
顕微鏡を用いて塩基性側から酸性側
に培養条件を変更したときの ER exit 
site の局在を経時的に観察した。その
結果、核近傍に密集していた ER exit 
図 3. 異なる pH の DMEM で培養したときの 
小胞体膜タンパク質 Sec12 の局在変化 
図 4. モータータンパク質による ER exit site の局在制御への 
関与の評価 
A. Nocodazole 処理下で酸性側から塩基性側に培養条件を変更した
ときにおける ER exit site の局在変化 
B、C. Kinesin-1 発現抑制 (B)、Dynein-1 発現抑制 (C)下で 
異なる pH の DMEM で培養したときの ER exit site の局在変化 
A 
B C 
siteが時間経過とともに細胞質側全体
に拡散していく様子が観察された。こ
の結果から、ER exit site の局在変化
は生成と消失によらず、ER exit site
を形成するタンパク質が小胞体膜上を
移動していくことで達成されることが
示唆された。 
 
3、 ER exit site の核近傍側への移動には Dynein-1 が関与している 
オルガネラの局在制御に微小管が関与していることが知られている。そこで、本現象に対する微小
管の関与を検討した。微小管脱重合剤 Nocodazole 処理を行うと、塩基性条件での培養時における ER 
exit site の核近傍の集積が抑制された (図 4 A)。従って、ER exit site の各近傍への集積に微小管
の関与が示唆された。 
次に、ER-Golgi 間の輸送
に関与するモーター分子で
ある Kinesin-1 (KIF5B)と
Dynein-1 をそれぞれ発現抑
制したときの ER exit site
の局在変化を評価した。そ
の結果、Kinesin-1 を発現抑
制しても ER exit site の局
在変化に影響は見られなか
ったが (図 4 B)、Dynein-1
を発現抑制すると、塩基性
条件の培養時における ER 
exit site の核近傍側への
集積が大きく抑制された 
(図 4 C)。以上のことから、
ER exit site の核近傍側へ
の移動にDynein-1の関与が
明らかとなった。 
 
 
 
 
 
 
図 5. p150Glued、Sec23A による ER exit site の局在制御への 
関与の評価 
A、B. p150Glued 発現抑制 (A)、Sec23A 発現抑制 (B)下で 
塩基性条件の DMEM で培養したときの ER exit site の局在変化 
 
A 
B 
4、 Dynein-1 は Sec23A と p150Glued を介して ER exit site の局在制御機構に関与する 
可能性がある 
p150Glued は、細胞質
ダイニンが微小管上で
機能するために必要と
なる Dynactin 複合体の
構成因子であり、ER exit 
site に局在する内側被
覆タンパク質 Sec23A と
直接結合することが知
られている。そこで、
Dynein-1はp150Gluedと
Sec23A との結合を介し
て ER exit site の局在
制御に関与する可能性
を考え、p150Glued と
Sec23A のそれぞれを発
現抑制したときの ER 
exit site の局在変化を
評価した。その結果、p150Glued、Sec23A のいずれを発現抑制しても塩基性条件の培養時に生じる ER 
exit site の核近傍への集積が抑制された (図 5 A、B)。一方、ER exit site に局在する別の被覆タン
パク質 Sec31A を発現抑制したときには、ER exit site は核近傍に集積したままであった (図 5 B)。
従って、Dynein-1 による ER exit site の核近傍への移行は、p150Glued と Sec23A との結合を介する
可能性が示唆された。 
 
 
【まとめと考察】 
本研究において私は、pH による ER exit site の局在変化を手段として用いることで、ER exit site
の局在がダイニンモータータンパク質により制御されていること、さらにその制御には、Dynactin 複
合体の構成因子 p150 Glued と ER exit site に局在する内側被覆タンパク質 Sec23A との直接的な結合
が必要である可能性を新たに見出した。 
p150 Gluedと Sec23Aとの結合はまた、COPⅡ被覆小胞の小胞体からの効率的な輸送に関与しており、
両者の結合が阻害されるとその輸送が遅延することが報告されている。これらのことから、p150 Glued
と Sec23Aとの結合を介した Dynein-1 による ER exit site の核近傍側への集積と、p150Glued と Sec23A
との結合による小胞体からの効率的な輸送が共役的に機能することによって、核近傍側に密集した ER 
exit site では効率的な輸送が生じている可能性が考えられる。 
今後は、この分子機構が巨大分子コラーゲンの分泌に対してどのように関与するのかを解析するこ
とによって、ER exit site の細胞内局在の違いに応じた機能のさらなる解明につながると考えられる。 


小胞体上の分泌タンパク質出芽部位ER exit siteの局在制御機構

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小胞体上の分泌タンパク質出芽部位ER exit siteの局在制御機構

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