学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 門脇 孝, 東京大学講師 細谷 紀子, 東京大学特任准教授 稲城 玲子, 東京大学准教授 滝田 順子, 東京大学講師 樋渡 光輝University of Tokyo(東京大学

Kogure Yasunori

木暮 泰寛

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【序⽂】 
 EVI1（ecotropic viral integration site-1）は造⾎細胞において重要な転写因⼦であり、特に造⾎
幹細胞を維持する上で必須である。また、EVI1 は急性⾻髄性⽩⾎病、慢性⾻髄性⽩⾎病あるい
は⾻髄異形成症候群などで⾼頻度に活性化されていることが知られている。EVI1 ⾼発現⽩⾎病
は極めて予後不良であるが、EVI1 が発現亢進する機構は不明な点が多い。特に、染⾊体異常を
有さず EVI1 発現が亢進している⽩⾎病が存在することも知られており、このタイプの EVI1 ⾼
発現機構を担うメカニズムを明らかにする必要があると考えた。 
 Transcription activator-like effector nuclease（TALEN）を⽤いると、任意位置でのゲノム改変が
可能になる。そこでヒト腫瘍細胞株 HEL, HEC1B のゲノムを改変し EVI1-eGFP レポーター細胞
の樹⽴を⾏った。このレポーター細胞を⽤いて cDNA ライブラリーによるスクリーニングを⾏
うことで、網羅的に EVI1 up-regulator を探索することができると考えた。 
 更に、EVI1 の転写調節は必ずしも転写因⼦によらず、エピゲノミックな制御である可能性を
考慮した。その中でもヒストンのメチル化修飾に着⽬し、EVI1 転写開始点付近で転写促進性の
ヒストンマークである Histone H3 Lysine 4 tri-methylation (H3K4me3)、 H3K36me3、H3K79me2
と抑制性のヒストンマークである H3K27me3 について探索した。 
 
【主な材料と⽅法】 
TALEN 発現ベクター及びドナーベクターの設計 
 TALEN 発現ベクターは ZiFiT Targeter で設計し、Joung Lab REAL Assembly TALEN kit を⽤いて
REAL 法で制作した。OCT4-eGFP-2A-Puro ベクターを改変して EVI1-eGFP-2A-Puro ドナーベク
ターを作成した。 
 
TALEN によるゲノム改変 
 ゲノム改変の細胞株として、EVI1 が発現しているヒト⽩⾎病細胞株 HEL とヒト⼦宮体癌細胞
株 HEC1B を⽤いた。HEL へのトランフェクションは NEPA21 electroporator を、HEC1B に対し
ては polyethylenimine をそれぞれ⽤いて⾏った。ゲノム改変細胞をクローン化した後、ゲノム改
変が⽬的の箇所で起こっているか PCR 法で確認した。また、フローサイトメトリーやウェスタ
ンブロットで GFP 発現を確認した。 
 
cDNA ライブラリーの作成 
 ヒト⽩⾎病細胞株 KU812 から mRNA を抽出し、Universal RiboClone cDNA Synthesis System を
⽤いて cDNA ライブラリーを作成した。cDNA を pMXs-Neo ベクターにクローニングした。 
 
single cell sort を⽤いたライブラリースクリーニング 
 cDNA ライブラリー発現アンフォトロピックウイルス粒⼦を Plat-A パッケージング細胞を⽤
いて作成し、ゲノム改変にて作成したレポーター細胞に感染させた。感染成⽴細胞のうち、GFP
シグナル上位 3 パーセンタイル集団に属する細胞を FACS AriaII を⽤いて single cell sort し、増殖
させた。各細胞のゲノムに挿⼊された cDNA 断⽚をサンガーシークエンスし、nucleotide BLAST
によって解析した。 
 
shRNA を⽤いた遺伝⼦ノックダウン実験 
 ラ イ ブ ラ リ ー ス ク リ ー ニ ン グ で 得 ら れ た 候 補 遺 伝 ⼦ そ れ ぞ れ に 対 す る shRNA を
pRSI12-U6-sh-HTS4-UbiC-TagRFP-2A-Puro レンチウイルスベクターを⽤いて HEC1B に導⼊した。
候補遺伝⼦と EVI1 の発現量変化を RT-qPCR で確認した。 
 
EVI1 プロモーター領域のヒストンメチル化修飾の解析 
 EVI1 発現⽩⾎病細胞株である KU812、HEL 及び EVI1 低発現⽩⾎病細胞株の HL60 に対し、
H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3、H3K79me2 に対する各抗体を⽤いてクロマチン免疫沈降
（ChIP）を施⾏した。EVI1 の転写開始点上流 5 kb 程度の領域内に設定したプライマーを⽤いて
qPCR を⾏った。 
 
【結果】 
HEL のゲノム改変 
 EVI1 終⽌コドンをターゲットにした TALEN 及び EVI1-2A-eGFP-PGK-Puro ドナーベクターを
作成し HEL のゲノム改変を⾏うと、フローサイトメトリーで GFP シグナルの陽性分画が出現し
た。この分画の細胞を単離してゲノムを解析すると、ゲノムの⽬的の位置にドナーベクター由
来の配列が挿⼊されていた。また、この細胞では GFP がタンパクレベルで発現していた。また、
すでに EVI1 を up-regulate することが知られている MLL 融合遺伝⼦をこのゲノム改変 HEL に導
⼊すると、細胞の GFP シグナルが増強され、レポーター細胞として有⽤であることが分かった。 
 
cDNA ウイルスライブラリーの作成 
 ⽩⾎病細胞株 KU812 は 3q26 異常を有さず EVI1 を⽐較的⾼発現しており、このような細胞で
は EVI1 up-regulator の mRNA を多量に含むと想定された。そこで、KU812 より cDNA を抽出し、
pMXs-NEO ウイルスベクターにクローニングした。ウイルスベクターライブラリーを⼤腸菌で
増幅すると同時に、ライブラリーの integrity や insert ⻑をコロニーPCR によって評価した。 
 
ゲノム改変 HEL を⽤いたライブラリースクリーニング 
 作成したゲノム改変 HEL にウイルスライブラリーを感染させた。GFP シグナル上位 3 パーセ
ンタイル分画を single cell sort し、挿⼊された cDNA ライブラリー由来の配列を解析したが、遺
伝⼦に該当しないゲノム領域の⼩断⽚が主に得られ、有意な候補遺伝⼦は得られなかった。 
 
HEC1B のゲノム改変とライブラリースクリーニング 
 スクリーニングのスループットを向上させるため、HEC1B をゲノム改変細胞として⽤いた。
HEL と同様にしてゲノム改変 HEC1B を樹⽴した。この細胞ではタンパクレベルで GFP が発現
しており、EVI1 発現量と GFP シグナルが相関していた。また、MLL 融合遺伝⼦の導⼊で GFP
シグナルが上昇した。 
 また、ゲノム改変 HEC1B を⽤い、HEL と同様の⼿順でウイルスライブラリーを感染させ GFP
シグナル上位 3 パーセンタイル分画に挿⼊された配列を解析したところ、EVI1 up-regulator 候補
として 2 種類の転写因⼦の配列が検出された。 
 
スクリーニング結果の確認 
 マイクロアレイの公開データを⽤い、腫瘍細胞株や急性⾻髄性⽩⾎病症例におけるこれらの
候補転写因⼦と EVI1 の発現量の相関関係をそれぞれ評価したが、相関関係を認めなかった。⼀
⽅、⽩⾎病細胞株で RT-qPCR を⾏い、両遺伝⼦と EVI1 の発現量の相関関係を評価したところ、
⼀⽅の転写因⼦と EVI1 の間に有意な相関を認めた。また、HEC1B にそれぞれの転写因⼦の
shRNA を導⼊したところ、ともに EVI1 発現量が低下した。 
 
ヒストン修飾による EVI1 転写調節の検討 
 EVI1 転写開始点付近のヒストンメチルを評価するため、KU812、HEL 及び HL60 で ChIP-qPCR
を施⾏した。3q26 異常を伴わない EVI1 ⾼発現株である KU812 では、EVI1 の転写調節領域にお
いて H3K4me3 や H3K27me3、H3K79me2 が特徴的に亢進していた。 
 
【考察】 
 本研究では第⼀に、EVI1 発現に相関して GFP シグナルを有する⽩⾎病細胞株を作成した。HEL
と HEC1B のゲノム改変を⾏ったところ、これらの細胞において GFP は発現し、そのシグナル
をフローサイトメトリーで検出することができ、改変に成功したと考えられた。ゲノム編集効
率は数%程度であり、既報と⽐してほぼ妥当だった。また、GFP シグナルの強弱と EVI1 発現量
は相関し、スクリーニング系として適切であると考えられた。 
 KU812 を⽤いて cDNA 発現ウイルスライブラリーを作成した。このライブラリーは、integrity
は確保されていたが insert の平均⻑が約 0.7kbp と短かった。またゲノム DNA やミトコンドリア
DNA 由来配列が混⼊していた。そのためライブラリーの品質向上によりスクリーニングの精度
向上の余地があると考えられた。 
 この cDNA 発現ウイルスライブラリーと、作成したレポーター細胞株を⽤いてスクリーニン
グを施⾏したところ、ゲノム改変 HEC1B を⽤いた実験で 2 種類の候補転写因⼦を同定した。
shRNA を⽤いてこれらの遺伝⼦をノックダウンすると EVI1 の発現量が低下した。したがって、
スクリーニング結果は妥当であったと考えられた。今後、これらの遺伝⼦の強制発現等で EVI1
発現との関連を詳細に検討する必要がある。 
 最後に、EVI1 制御にエピゲノミックな修飾が関与している可能性を考慮し、⽩⾎病細胞株で
EVI1 プロモーター領域のヒストンメチル化を ChIP-qPCR で分析した。KU812 では H3K4me4 の
他に H3K27me3 と H3K79me2 が亢進していることが特徴的であった。このことから EVI1 プロモ
ーター領域の bivalent な修飾を保持しつつも EVI1 発現が亢進している可能性が考えられた。⽣
理的なプロモーターによる EVI1 の転写活性化においてはこれらのヒストン修飾が重要な役割を
担っている可能性が⽰唆されたた。 


ヒト白血病遺伝子EVI1の制御因子の探索

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ヒト白血病遺伝子EVI1の制御因子の探索

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