Faber, Cornelius

Hovedformålet med denne Ph.D. afhandling var at evaluere traditionelle og nye indgangsvinkler til karakterisering og kvantificering af proteiners opløselighed og krystalvækst under indflydelse af opløsningens egenskaber som f. eks. forandringer i salt koncentrationen, pH og temperaturforskelle. Der blev desuden lavet overordnede fasediagrammer under udvalgte betingelser. Metoderne blev evalueret med det formål at reducere protein forbruget, også når der arbejdes med mindre rene enzymer. Til den eksperimentelle del af denne afhandling blev der brugt enzymkoncentrater af to rekombinante -amylaser fra Bacillus halmapalus (BHA) og Bacillus licheniformis (BLA), som var blevet oprenset til teknisk grad. Udviklingen af optimerede mikrobielle stammer sammen med fremskreden gæringsteknologi fører til et renere industrielt gæringsmedie med højere produkt koncentration, som vil muliggøre en økonomisk masse-produktion af proteiner af lav værdi. Samtidig øges risikoen betragteligt for at operere over opløslighedsgrænsen og deraf følgende ukontrolleret precipitering eller krystalformation, hvilket kan føre til væsentlige problemer i produktionsforløbet, f. eks. produkttab under almindelige enhedsoperations til fjernelse af biomasse, som f. eks. centrifugering eller filtrering. Udvikling og gennemførelse af downstream processer under betingelser, der ligger tæt på opløslighedsgrænsen er særlig udfordrende og afhænger ofte af trial-and-error pga. mangel på omfattende data for proteinopløslighed for processrelevante betingelser. Således er information omkring opløslighedsegenskaber af vidtrækkende værdi, ikke kun under udviklingen af rensningsprocesserne, men også ved den indledende screening rutiner af nye lovende molekyler. Opløslighedsdata er kun tilgængelig for et begrænset antal proteiner, eftersom traditionelle metoder for udarbejdelse af opløslighedskurver kræver store mængder af protein, samt at krystallisering af disse proteiner er mulig indenfor en rimelig tidsfrist – to kriterier som ofte ikke er til stede (kapitel 1). Der er lavet en omfattende beskrivelse af BHA’s oopløselighedsprofil (kapitel 2). Opløslighedskurverne blev opstillet ved hjælp af klassiske temperatur-kontrollerede batch krystalliserings processer i Eppendorfrør med et arbejdsvolumen på 1 mL. Indflydelsen af temperatur, pH og udvalgte kationer og anioner fra Hofmeister serien på opløsligheden blev kvantificeret. Den viste sig at være stort set uafhængig af temperatur men stærkt afhængig af pH. Hofmeister serien for anioner blev fulgt i den korrekte rækkefølge, ligeledes blev rækken fulgt for de monovalente kationer, med undtagelse af lithium. Det var forventet at den ville være den ringeste precipitant, men viste sig at være den bedste. Der blev gennemført målinger af zeta-potentialet, og det viste at lithium øgede det isoelektriske punkt (pI) af BHA, hvilket kunne forklare den uventede effekt på enzymets opløslighed under tilstedeværelse af denne ion. I kapitel 3 blev batch krystalliserings processer af BHA med udgangspunkt i tre forskellige overmættelser studeret nærmere. Krystallernes størrelsesfordeling, deres antal samt koncentrationen af opløst protein blev målt som funktion af tid. Allerede under pH justeringen for at skabe den overmættede opløsning fremkom en betragtelig mængde krystaller. Indenfor de første to til tre timer af processen øgedes krystal koncentrationen yderligere, men den forblev derefter konstant i en bestemt periode, hvis længde blev bestemt af graden af overmætning. Kun hvis overmætningen var stor nok, ville krystalkoncentrationen øges yderligere og en ligevægt opnået indefor den eksperimentelle tidshorizont på højest 48 timer. I modsætning til krystal koncentrationen ændrede fordelingen af krystal størrelserne sig ikke under processen. Den gennemsnitlige diameter af krystallerne forblev konstant og var mellem 4 og 5 µm. Således kunne man ikke konstatere fortsat vækst. Fordelingen af krystal størrelserne viste sig grundlæggende at være uafhængig af overmætningen. Indflydelsen af udvalgte kationer og anioner fra Hofmeister serien på opløslighed af BLA er præsenteret i kapitel 4. I modsætning til BHA, er BLA stabil på begge sider af pI, hvilket muliggør at teste hypotesen om at Hofmeister serien bliver vendes om afhængigt af fortegnet på proteinets ladning. Opløsligheden af BLA blev målt ved pH 6, 7 og 8 ved salt koncentrationer på 0 M, 0,1 M og 0,5 M. Fortegnet på proteinets ladning i saltopløsningerne blev bestemt ved at måle zeta-potentialet ved de førnævnte pH-værdier, men kun i opløsningerne med 0 M og 0,1 M salt. Målinger af zeta-potentialet var upræcist i saltkoncentrationer på over 0,1 M, derfor kunne den resulterende pI ved 0,5 M ikke bestemmes. Ved alle testede betingelser blev den laveste opløslighed fundet ved pH 7, med undtagelse af 0,5 M natrium thiocyanate. En invertering af Hofmeister serien for kationer og anioner ved at ændre fortegnet på proteinets ladning kunne ikke bekræftes. I kapitel 5 beskrives mikrotiterpladers potentiale for at frembringe BHA fasediagrammer bestående af zonerne precipitation og nukleation, såvel som de metastabile og undermættede zoner. Disse temperatur-kontrollerede mikro-batch eksperimenter blev gennemført ved en arbejdsvolumen på 200 µL og udfældningerne blev analyseret ved lysmikroskopi. Herved kunne betingelser for dannelse af amorfe udfældninger og forskellige typer krystaller identificeres som funktion af startbetingelserne. Efter 4 dages inkubation blev mikrotiterpladerne undersøgt, og sammen med opløseligheds data fra kapitel 2 kunne fasediagrammerne konstrueres. Disse blev bestemt som en funktion af pH, koncentrationen af natrium klorid ved pH 7 og 9, samt koncentrationen af natrium thiocyanat ved pH 7. I alle tilfælde kunne man identificere en bred nukleationszone. Amorft precipitat opstod kun med ved en høj initiel overmætning. For natrium klorid ved pH 9 blev der ikke fundet noget amorft precipitat. Den metastabile zone var meget smal for i systemer med natrium klorid ved pH 9, og som funktion af pH uden tilsat salt. Dog blev den metastabile zone bredere når natrium klorid koncentration øgedes, og den blev endnu bredere i tilstedeværelsen af natrium thiocyanat, begge dele blev målt ved pH 7. Selvom proteinforbruget kunne reduceres betragteligt vha. de førnævnte metoder, så forbliver tilstedeværelsen af tilstrækkelige mængder af protein samt dets krystalliserbarhed en begrænsning som vil være svær at overvinde i traditionelle opløselighdes test. Derfor blev yderligere metoder undersøgt i kapitel 6, hvor BHA blev anvendt som model protein. Bestemmelsen af den anden osmotiske virial koefficient (B22) er et attraktivt alternativ til målinger af proteiners opløslighed, og har den fordel at eksperimenter kan gennemføres i undermættede opløsninger, således at man ikke skal bruge store mængder protein og tidskrævende krystallisationsprocesser. B22 repræsenterer en Boltzmann-vægtet gennemsnitlig måling af protein-protein interaktioner, hvor positive B22-værdier modsvarer frastødende interaktioner, og negative værdier modsvarer tiltrækkende interaktioner. Ved bestemmelsen af B22 kan man således forudsige processer for hhv. faseseparation og aggregering. Dynamisk lysspredning (DLS) af de her anvendte BHA preparationer viste tilstedeværelsen af signifikante mængder af opløslige enzymaggregater. Disse vil interferere ved bestemmelsen af B22 ved lysspredning, hvorfor det blev konkluderet at denne metode ikke var velegnet til bestemme B22 i BHA opløsninger. En alternativ metode til lysspredning er self-interaction chromatography (SIC), som før har vist sig at kunne tilvejebringe B22-værdier, som kvantitativt stemmer overens med værdierne opnået vha. lysspredning, men som kan siges at være noget mere effektiv hvad angår forbrug af protein og tid. Eksperimenterne fra kapitel 6 bekræfter, at SIC_metoden ikke påvirkes af aggregater. Derudover blev en stor mængde B22-data genereret ved SIC, og der blev fundet en god overensstemmelse mellem B22 og opløsligheden af BHA. Hofmeister seriens effekt på opløseligheden blev bekræftet for både kationer og anioner, og for såvel B22 som for enzymopløseligheden ved pH 9 blev der observeret et minimum ved natriumnitrat og natriumthiocyanat koncentrationer mellem 0,1 M og 0,2 M. Sammenhængen mellem opløslighed og B22 er før blevet etableret af f. eks. Haas-Drenth-Wilson modellen, som i denne afhandling blev konstateret at være i kvalitativ overensstemmelse med de observerede tendenser for BHA.The overall aim of this thesis was to evaluate traditional and novel approaches for the characterisation and quantification of the influence of different solution properties such as changes in salt concentration, pH and temperature on protein solubility, crystal growth and the overall protein phase diagram under process relevant conditions. The tools were evaluated with the aim of reducing protein demand whilst operating in the presence of impurities. Concentrates of two recombinant α-amylases of Bacillus halmapalus (BHA) and Bacillus licheniformis (BLA) which had been purified only to technical grade were used in the experimental part of this thesis. The development of optimised microbial strains along with advanced fermentation technologies leads to cleaner industrial fermentation broths with high product concentrations, facilitating the economical production of low-value-proteins in large-scale. At the same time, the risk of operating above the solubility limit and consequent uncontrolled formation of amorphous precipitation or crystals is significantly enhanced and can lead to substantial problems during processing, e.g., the loss of product during commonly employed biomass removal steps such as centrifugation or filtration. The design and the operation of downstream processes under conditions close to the solubility limit are particularly challenging and often rely on trial-and-error due to the absence of comprehensive solubility data for process relevant conditions. Thus information on the solution properties of proteins are of far reaching valuenot only for the design and operation of recovery processes but also in initial screening routines for promising new candidate molecules. However, solubility data are available for a limited number of proteins only, since the traditional determination of solubility curves requires a substantial amount of protein and that their crystallisation is possible within a reasonable time frame, constraints which are often not met (Chapter 1). In Chapter 2 solubility properties of BHA were extensively studied. Solubility curves were obtained by classical temperature-controlled batch crystallisation processes conducted in Eppendorf tubes at a working volume of 1 mL. The influence of temperature, pH and selected cations and anions from the Hofmeister series on the solubility was quantified. The solubility was found to be almost insensitive to temperature but strongly dependent on pH. The Hofmeister series for anions was followed in the correct order which was also true for monovalent cations, with the exception of lithium which was expected to be the worst precipitant but found to be the best. Measurements of the zeta potential were conducted and have demonstrated that lithium increased the isoelectric point (pI) of BHA which could explain the unexpected solubility behaviour of the enzyme in the presence of this ion. In Chapter 3 batch crystallisation processes of BHA started from three differentsupersaturations were further studied. The crystal size, size distributions and the crystal concentration as well as the protein concentration in the supernatant were measured as a function of time. A significant number of crystals already formed during pH-adjustment to induce the supersaturation. Within the first two to three hours of the process, the crystal concentration further increased but then remained constant for a certain period, the length of which was determined by the supersaturation. Only if the supersaturation was high enough, the crystal concentration further increased and reached equilibrium within the experimentalrun time of maximum 48 hours. Contrary to the crystal concentration, the crystal size distribution did not change during the process and the mean diameter of the crystals remained constant and ranged between 4 and 5 µm such that no continuous growth could be observed. The crystal size distribution was essentially independent of the supersaturation. The influence of selected cations and anions from the Hofmeister series on the solubility of BLA is presented in Chapter 4. In contrast to BHA, BLA is stable on both sides of the pI, allowing testing of the hypothesis that the Hofmeister series is reversed depending on the sign of the protein net charge. The solubility of BLA was measured at pH 6, 7 and 8 at salt concentrations of 0 M, 0.1 M and 0.5 M. The sign of the protein net charge in the saltsolutions was determined by measuring the zeta potential, at the above mentioned pH-values in the presence of 0 M and 0.1 M salt only. Zeta potential measurements became inaccurate atsalt concentrations higher than 0.1 M, thus the resulting pI at 0.5 M could not be determined. With the exception of 0.5 M sodium thiocyanate, a minimum in solubility at pH 7 was found for all of the measured conditions. The effect of anions on α-amylase solubility was observed to follow the Hofmeister series. A reversal of the Hofmeister series for cations and anions depending on the sign of the protein net charge could not conclusively be demonstrated. The potential of microtitre plates to generate BHA-phase diagrams consisting of precipitation and nucleation zones, as well as metastable and undersaturated zones is demonstrated in Chapter 5. Temperature-controlled micro-batch experiments were conducted at working volumes of 200 µL and the precipitation behaviour analysed by light microscopy. The formation of amorphous precipitate and crystals of different habit was related to the corresponding starting conditions allowing different zones describing the precipitation behaviour to be defined. Inspection of the microtitre plates was conducted after four days andthe solubility data presented in chapter 2 were incorporated. Phase diagrams were recorded as a function of pH, and of the concentration of sodium chloride at pH 7 and 9 and of sodium thiocyanate at pH 7, respectively. In all cases, a wide nucleation zone could be identified. Amorphous precipitate was formed only at very high initial supersaturations. For sodium chloride at pH 9, no amorphous precipitate was found. At the termination of the experiment, the metastable zone was found to be very narrow for sodium chloride at pH 9 and as a function of pH in the absence of added salts. In contrary, the metastable zone broadened with sodium chloride concentration and even more with sodium thiocyanate concentration, both at pH 7. Although the protein demand could be significantly be minimised by the methods presented above, the availability of sufficient protein and the crystallisability may still remain constraints which are hard to overcome, thus other methods were examined in Chapter 6 using BHA as model protein. Determination of the second osmotic virial coefficient (B22) is an attractive alternative to solubility measurements and offers the distinct advantage that experiments can be conducted in undersaturated solutions so that little protein and no timeconsuming crystallisation processes are needed. The B22 represents a Boltzmann-weighted average measure of the protein-protein interactions where positive B22-values correspond to repulsive interactions, while negative values correspond to attractive interactions, thus allowing for a prediction of phase separation and aggregation processes. Dynamic light scattering (DLS) of the BHA preparation used during the experimental work of this thesis demonstrated the presence of significant amounts of soluble enzyme aggregates which was concluded to be why static light scattering (SLS) did not lead to a reliable determination of B22 values of BHA solutions as used in this study. An alternative method to SLS is selfinteraction chromatography (SIC) which has previously been shown to provide B22-values which agree quantitatively with those made by SLS but is at least one order of magnitude more efficient in terms of protein consumption and time needed. The experiments presented in Chapter 6 confirm the insensitivity of SIC towards aggregates. Furthermore, a large set ofB22-data was generated and good agreement between B22 and solubility measurements was found for BHA. The Hofmeister series was confirmed for both cations and anions and a minimum in B22 as well as in solubility at pH 9 was found for sodium nitrate and sodium thiocyanate between 0.1 M and 0.2 M. Correlations between solubility and B22 have previously been established e.g., by the Haas-Drenth-Wilson model which in this present thesis was found to be in qualitative agreement with the observed trends for BHA

Online Research Database In Technology

Measurement and Prediction of Protein Phase Behaviour and Protein-Protein Interactions

http://orbit.dtu.dk/ws/files/5072042/thesis%20-cornelius%20faber.pdf

Measurement and Prediction of Protein Phase Behaviour and Protein-Protein Interactions

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Online Research Database In Technology