学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 東條 有伸, 東京大学准教授 新井 郷子, 東京大学准教授 瀧本 禎之, 東京大学講師 田中 哲洋, 東京大学特任講師 牛久 綾University of Tokyo(東京大学

Higa Takashi

比護 貴史

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博士論文（要約） 
 
 
ノックインマウスモデルによるＤＮＭＴ３Ａ変異の
造血機構における意義の探索  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
比護 貴史 
 
 
 
 論文の内容の要旨 
 
論文題目   ノックインマウスモデルによる DNMT3A 変異の造血機構に  
おける意義の探索  
比護  貴史  
急性骨髄性白血病（ acute myeloid leukemia :AML）は、幼弱な骨髄系細
胞の自律的増殖を特徴とする血液腫瘍であり、短期間で致死的となる重篤な
疾患である。近年飛躍的に進歩した次世代シークエンスシステムにより AML
おける遺伝子変異プロファイルが網羅的に明らかになってきており、こうし
た解析により新たに同定された新規遺伝子変異が AML の発症及び維持にお
いてどのような役割を担っているかを明らかにしていくことで、新規治療の
開発やさらなる治療成績の改善につながっていくものと考えられる。  
 本 研 究 に お い て 我 々 が 着 目 し た DNA methyltransferase 3 alpha 
（DNMT3A）変異は 2010 年に新たに AML において存在が報告されたエピ
ゲノム制御遺伝子の変異であるが、特に染色体異常を有さない正常核型 AML
において 2 割程度に存在が認められておりエピゲノム関連遺伝子変異のなか
でも最も頻度の多いものの一つである。DNMT3A は DNA 中のシトシンをメ
チル化修飾し 5-メチルシトシンに変換する酵素をコードしている遺伝子で
あり、特に de novo の DNA メチル化パターン形成に寄与している。DNMT3A
変異を有する造血器腫瘍患者において、非腫瘍性の骨髄細胞や治療後の血球
細胞で DNMT3A 変異がしばしば存在していることが報告されている。さら
に、健常高齢者においても 5~10%の頻度で DNMT3A 変異を持つクローンが
存在することも明らかになっている。また、DNMT3A 変異を有する AML 細
胞は IDH1 変異や NPM1 変異、FLT3-ITD 変異といった他のドライバー変異
を伴うことから、DNMT3A 変異を有する造血幹細胞が前白血病造血幹細胞、
すなわち正常血球への分化能や自己複製能を保ちつつクローン性に緩やかに
増大し、ドライバー変異の獲得により腫瘍化する幹細胞として寄与している
のではないかと推測されている。この DNMT3A 変異と白血病の発症及び維
持の関係を示唆するいくつかの実験的な報告が存在するが、それらは変異型
DNMT3A の過剰発現やノックアウトマウスモデルによる報告であり、これま
で内在性レベルの変異型 DNMT3A の発現が造血系にもたらす影響について
の報告はいまだにない。従って、本研究では Cre-loxp システムを用いて造血
器細胞特異的に Dnmt3a 変異をノックインできるマウスモデルを作製し、そ
の機能的意義に迫ることを目的とした。なお、AML における DNMT3A 変異
はその大部分が R882H および R882C という点突然変異であることから、マ
ウスにおける相同部位である R878C 変異をノックインすることとした  
 本研究において、Dnmt3a 変異をノックインしたマウスは造血器腫瘍を自
然発症することはなく、内在性レベルの Dnmt3a 変異が単独で腫瘍化を引き
起こす可能性は低いと考えられた。このことから、DNMT3A 変異を有する白
血病の発症過程においてこの変異が、細胞増殖をもたらすクラスⅠ変異と分
化異常をもたらすクラスⅡ変異が合わさることで異常な骨髄芽球の無秩序な
増殖、すなわち AML の発症がおきるという古典的発症モデルに先立つ形で
発症に寄与しているのではないかと考えられた。  
 私は、本研究において Dnmt3a 変異は単独で骨髄中の長期造血幹細胞
（Long term –Hematopoietic Stem Cell  :  LT-HSC）分画の増大を引き起こ
すが、一方でこの増大は LT - HSC 分画のみにとどまることを示した。また、
Dnmt3a 変異を有する LT-HSC では静止期に存在している細胞の割合が増加
していたことを併せて示した。マウスにおける造血細胞は、LT-HSC を頂点
としたヒエラルキーのもとで下流に向かい分化していくことが知られている
が、LT-HSC の殆どは抗がん剤投与時や瀉血時など血球細胞が大幅に失われ
るような非常時にのみ細胞周期に入り、分裂を起こして造血細胞の回復を導
く存在であり、平常時においては前駆細胞が造血を支える役割を果たしてい
ることが知られている。本研究においては、そのような平常時では造血機構
の構築に寄与しておらず殆ど細胞分裂を行っていない LT- HSC が増加して
いるために下流の分化細胞が増加していないのだと考えられた。  
 さらに、コロニー継代実験を行い、Dnmt3a 変異を有する造血幹前駆細胞
は、 in vitro 環境で自己複製能および増殖能が亢進していることを示した。
Dnmt3a 変異を有さないマウス由来の造血幹 /前駆細胞は 4 継代目までにコロ
ニー形成能を失っており、本研究で使用した半固形培地による培養と継代は
マウス造血幹細胞の自己複製能に対し抑制的に働く環境であると言える。こ
うした環境下において Dnmt3a 変異はコロニー継代数の増加および各継代時
におけるコロニー形成数の増加をもたらしており、造血幹前駆細胞の自己複
製能および増殖能を亢進させていると考えられる。  
これらのことから、Dnmt3a 変異を有する造血幹細胞は、その多くが静止期
にあることで平常時の造血機構には大きな影響を及ぼさないが、細胞周期に
エントリーした場合には自己複製能や増殖能が亢進していることが示唆され
る。このような幹細胞性の維持機能が造血器腫瘍を発症していない健常高齢
者における DNMT3A 変異クローンの存在や拡大につながっており例えば抗
がん剤や紫外線への曝露、感染や失血などの外的刺激により前駆細胞以降が
枯渇して造血幹細胞が分裂せざるを得ない状況や、あるいは加齢に伴い徐々
に造血幹細胞が静止期から動員されていく中で DNMT3A 変異を有する細胞
が増加していくというモデルが考えられる。さらに、造血幹細胞を強制的に
分裂させると一定の割合で DNA 損傷が蓄積されていくことが知られており、
DNMT3A 変異陽性造血幹細胞が分裂し徐々にクローンを拡大していく過程
で DNA 損傷が蓄積されていくことで造血器腫瘍の発症につながることが推
測される。さらに、DNMT3A 変異は AML において予後不良因子であること
が知られているが、抗がん剤は細胞周期依存性の薬剤が多く、静止期にある
DNMT3A 変異陽性造血幹細胞には効果が減弱する可能性があり、また抗がん
剤による造血ストレスによって DNMT3A 変異クローンがむしろ拡大するこ
とが治療抵抗性を付与している可能性が考えられた。  
 この DNMT3A 変異細胞の骨髄におけるクローン性の増加を確かめるため
にマウスを用いた競合的移植モデルを作成しキメリズムの解析を行ったが、
本研究では骨髄内環境における Dnmt3a 変異細胞の野生型細胞に対する優位
性を実証することはできなかった。即ち、本研究結果から Dnmt3a R878C 変
異は他の AML におけるドライバー変異でみられるような、増殖や造血再構
築における強い優位性は単独では有していないことが示唆された。  
 さらに、DNMT3A 変異はゲノム全体のメチル化状態の変化を起こしている
と考えられるため、多くの遺伝子の発現に変化が起こることが予測されるが、
DNMT3A 変異による静止期造血幹細胞の増加の原因となりうる遺伝子群の
発現解析を行った結果、Cdc20、Cdc45l、Trp53 などの遺伝子発現の上昇や
Ccnd1、Tgfb1、Cdc6 などの遺伝子発現の低下が明らかとなった。Cdc20、
Cdc45l、Cdc6、Cdc45l は DNA の複製過程で機能する遺伝子であるが、特に
DNA 損傷存在下におけるチェックポイント応答に密接にかかわっている。
Tgfb1 は TGF-β をコードしている遺伝子であり、TGF-β は多くの腫瘍におい
て発症早期には腫瘍抑制的に働くと報告されている。また Trp53 はがん抑制
遺伝子としてその存在を広く知られているが、細胞周期制御の中心となる遺
伝子でもあり、ノックダウンにより静止期の細胞が減少することから、本研
究で見出された静止期造血幹細胞の増加と Trp53の発現上昇に密接な関わり
があることが推測された。  
まとめると、私は本研究において、Dnmt3a R878C 変異を血球系細胞にノ
ックインしたマウスでは LT-HSC 分画が増大することを示し、さらにその分
画では細胞周期における静止期細胞の比率が増加することを示した。さらに、
この Dnmt3a R878C 変異は in vitro において造血幹細胞の自己複製能と増殖
能の亢進をもたらすことを示した。また、Dnmt3a 変異が Cdc20, Cdc45l, 
Trp53 の発現上昇および Ccnd1、Tgfb1、Cdc6 の発現低下をもたらすことを
示した。これらの知見は、DNMT3A 変異を有する細胞が造血幹細胞分画にお
いて幹細胞機能を保ちながら緩徐に増加し、その過程でドライバー変異を獲
得していくことで白血病を発症する可能性を示すものである。こうした
DNMT3A 変異における増殖・細胞周期制御のより詳細な分子機構の解明が、
DNTMT3A 変異陽性白血病の発症抑制や治療抵抗性の解消につながっていく
ものと考えられる。  
 


ノックインマウスモデルによるＤＮＭＴ３Ａ変異の造血機構における意義の探索

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ノックインマウスモデルによるＤＮＭＴ３Ａ変異の造血機構における意義の探索

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