学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 難波 成任, 東京大学教授 宇垣 正志, 東京大学准教授 勝間 進, 東京大学准教授 山次 康幸, 東京大学特任准教授 藤本 優University of Tokyo(東京大学

Keima Takuya

桂馬 拓也

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［ 別 紙 ２ ］ 
 
論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 
 
 
申請者氏名 
 
植物ウイルスには効果的な化学薬剤が存在しないため、抵抗性品種はウイルスの重要
な防除手段である。様々な作物においてウイルス抵抗性品種が育種されているが、その
うち約半数の抵抗性遺伝子座は劣性であると考えられている。しかし、植物ウイルスに
対する劣性抵抗性遺伝子の知見は極めて限られている。 
既報の劣性抵抗性遺伝子の多くは、翻訳開始因子 eukaryotic translation initiation factor 
(eIF) 4E、及びそのアイソフォームである eIFiso4E をコードする。これらの因子は mRNA
のキャップ構造に結合し、翻訳反応の開始に寄与する。植物には、eIF4E、eIFiso4E に
加え、さらなるアイソフォームとして novel cap binding protein (nCBP) が存在する。し
かしながら、nCBP の欠損や変異によるウイルス感染阻害は報告されておらず、nCBP
が eIF4Eや eIFiso4Eと同様にウイルスに対する劣性抵抗性遺伝子として働くかは不明で
あった。本研究では、nCBP の変異体植物で Alphaflexivirus 科および Betaflexivirus 科の
様々な植物ウイルスの感染が阻害されることを明らかにした。さらに、plantago asiatica 
mosaic virus (PlAMV; Alphaflexivirus科 Potexvirus属) を用いて、ウイルス感染時に nCBP
が果たす機能を明らかにした。 
 
１．Alphaflexivirus 科および Betaflexivirus 科ウイルスに対する劣性抵抗性遺伝子 nCBP
の同定 
eIF4Eアイソフォームをコードする遺伝子(eIF4E、eIFiso4E、nCBP) のそれぞれを欠
損したシロイヌナズナ変異体に GFP発現 PlAMV (PlAMV-GFP) を機械接種し、感染に
伴う GFP 蛍光斑を観察した。その結果、ncbp 変異体において蛍光斑の大きさが顕著に
低下した。定量 RT-PCR 解析により ncbp変異体の接種葉におけるウイルス RNAの蓄積
量は、野生型植物と比較して有意に減少していることを明らかにした。更に、ncbp 変
異体の上位葉における PlAMV の検出頻度も低下し、検出された場合にも PlAMV 蓄積
量は野生型植物に比べて有意に減少していた。ncbp変異体に nCBP遺伝子を形質転換し
た相補系統においては、接種葉におけるウイルスの蓄積量、および上位葉におけるウイ
ルスの検出頻度は野生型植物と同程度に回復した。これらの結果から、nCBP の変異体
植物では PlAMV の感染が阻害され、その全身感染が遅延することが示された。 
nCBPの欠損が PlAMV 以外の植物ウイルスの感染に影響するか解析するため、さま
ざまな植物ウイルスを ncbp 変異体、相補系統、野生型植物に接種し、接種葉における
ウイルス蓄積量を定量した。その結果、Alphaflexivirus 科 Potexvirus 属の Alternanthera 
mosaic virus および Cymbidium mosaic virus、Alphaflexivirus科 Lolavirus属の Lolium latent 
virus、Betaflexivirus 科 Carlavirus 属の Potato virus Mの蓄積量が、ncbp変異体において
野生型植物に比べて減少し、相補系統では回復した。従って、nCBP の欠損によって、
桂馬 拓也 
Alphaflexivirus 科および Betaflexivirus 科の植物ウイルスの感染が阻害されることが明ら
かとなった。一方で、Potyvirus 科 Potyvirus 属の Turnip mosaic virus や、Virgavirus 科
Tobamovirus 属の Youcai mosaic virus の蓄積量は、ncbp 変異体においても野生型植物と同
等であった。 
 
２．nCBPの欠損による Potexvirus 属ウイルスの感染阻害機構の解析 
Potexvirus 属ウイルスの感染時に nCBP が果たす役割を明らかにするため、ウイルス
の細胞間移行を観察した。パーティクルボンバードメント法により PlAMV-GFPを ncbp
変異体および野生型植物に接種し、ウイルスの広がりを経時的に観察した。その結果、
ウイルスの細胞間移行に伴い拡大する蛍光斑の面積は ncbp 変異体で有意に減少し、細
胞間移行が阻害されていることが示された。次いで、単細胞における PlAMV の増殖が
阻害されているかを解析した。ncbp 変異体および野生型植物から調整したプロトプラ
ストに PlAMV を接種し、プロトプラスト内でのウイルス蓄積量を定量 RT-PCR 法およ
びノーザンブロット法により評価したところ、ncbp変異体においてゲノム RNAは野生
型植物と同等に蓄積していた。従って、ncbp 変異体において細胞間移行の段階が阻害
されていることが示された。 
nCBP の欠損によってウイルスの細胞間移行が阻害されたことから、細胞間移行に関
わるウイルスタンパク質の蓄積量を、ncbp 変異体と野生型植物の間で比較した。ncbp
変異体および野生型植物に PlAMV-GFPをアグロインフィルトレーション法によって接
種し、接種葉から抽出した全タンパク質を用いたウェスタンブロッティングを行い、
PlAMV ゲノムにコードされる 5 つのタンパク質を検出した。その結果、移行タンパク
質 triple gene block protein (TGB) 2 および TGB3の蓄積量が、ncbp変異体において有意
に低下していた。その他の 3 つのタンパク質は、ncbp 変異体と野生型植物間で同等に
蓄積していた。以上より nCBP は植物細胞内での TGB2、TGB3 の蓄積に特異的に関与
すると考えられた。TGB2、TGB3 は Potexvirus 属ウイルスが細胞間移行するうえで必須
なタンパク質であることから、ncbp変異体では TGB2、TGB3 の蓄積量が低下したこと
で、PlAMVの細胞間移行が阻害されたと考えられた。 
 
本研究により、Alphaflexivirus 科および Betaflexivirus 科ウイルスの感染に nCBP が関
与することが明らかとなった。植物ウイルスの感染に nCBPが重要であることを明らか
にした初めての知見であり、また本発見により eIF4E遺伝子の全てのアイソフォームが
ウイルスに対する劣性抵抗性遺伝子として働きうることが初めて明らかになった。さら
に本研究では、nCBP の変異体で Potexvirus 属ウイルスの細胞間移行が阻害されるメカ
ニズムを明らかにした。これらの知見はウイルスの感染機構を理解するうえでも学術的
価値が高く、劣性抵抗性遺伝子を利用したウイルス耐性植物の開発にも寄与する農学的
に重要な研究成果である。以上より、審査委員一同は本論文が博士（農学）に値するも
のと認めた。 
 


フレキシウイルスの細胞間移行を阻害する劣性抵抗性遺伝子に関する研究

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フレキシウイルスの細胞間移行を阻害する劣性抵抗性遺伝子に関する研究

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