学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 高戸 毅, 東京大学准教授 小川 純人, 東京大学講師 藤尾 圭志, 東京大学講師 廣瀬 旬, 東京大学講師 篠田 裕介University of Tokyo(東京大学

MORI YOSHIFUMI

森 芳史

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博士論文(要約) 
 
論文題目 S100A1・S100B の骨格系組織の発生及び関節軟
骨の維持に対する機能の解析 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
氏名  森 芳史 
 
博士論文（要約） 
 
  
         論文題目 S100A1・S100Bの骨格系組織の発生及び関節軟骨の維持に対する機能の解析 
   
  氏名  森 芳史 
 
 
 
 
【要旨】 
  S100ファミリータンパクは低分子の調節タンパクで、標的タンパクと結合して多彩な生理的機能を
発揮するが、細胞内で標的タンパクと結合して機能を発揮する細胞内作用と、細胞膜表面受容体への結
合を介して機能を発揮する細胞外作用の双方がある。細胞内作用としては、リン酸化の抑制、酵素活性
の調節等が知られ、細胞外作用としては、炎症機構の活性化等が知られる。以前の研究で我々は、S100
ファミリータンパクのうちのS100A1とS100Bが、軟骨発生分化のマスター転写因子SOX9とそのco-factor
であるSOX5とSOX6からなるSOX trioにより発現誘導される事を発見した。更に、軟骨系細胞株ATDC5
を用いたin vitroでの機能解析で、S100A1とS100Bは肥大分化や石灰化を抑制する作用を持つ事を明らか
にした。SOX trioにより直接誘導される事から、S100A1とS100Bは軟骨発生・分化に重要な分子である
可能性がある。更に、変形性関節症の発症・進行の過程では、軟骨細胞に発生過程における肥大分化の
際と類似した表現型や遺伝子発現の変化が現れる事が知られているが、この事から、in vitroで肥大分化
を抑制すると示されているS100A1とS100Bは、変形性関節症治療に有用である可能性がある。しかしな
がら、S100A1とS100Bがin vivoで軟骨の発生・分化や軟骨変性疾患の病態にどのように関与しているか
は、未だに解明されていない。 
本研究は、S100A1とS100Bの軟骨発生・分化及び軟骨変性病態との関わりを検証し、運動器疾患の新規
治療法開発に発展させうる知見を得る事を目標として行った。 
まず、軟骨組織発生に対してS100A1・S100Bがどう関与するか検討するため、S100a1・S100bのダブル
ノックアウトマウスの軟骨組織を継時的に解析した。胎生12.5日でAlcian Blue染色により軟骨原基の形
成を解析したが、S100a1・S100bダブルノックアウトマウスと野生型とで明らかな違いは見られなかっ
た。次いで、胎生16.5日でAlcian Blue / Alizarin Redによる二重染色を行ったが、この時点でも明らかな
軟骨形成や石灰化の異常は見られなかった。長管骨・腰椎の長さも、S100a1・S100bダブルノックアウ
トマウスと野生型との間で差が無かった。生後1日の脛骨を用いて組織切片を作製してHematoxylin-Eosin
染色やvon Kossa染色により組織学的解析を行ったが、S100a1・S100bダブルノックアウトマウスの成長
板軟骨の増殖層・肥大層の長さや構造・石灰化の程度に明らかな異常はなかった。さらに、生後に表現
型が出現してくる可能性を考え、性成熟に達する生後8週齢のマウスでの解析を行った。軟X線撮影を用
いた放射線学的解析や組織染色により解析したが、S100a1・S100bダブルノックアウトマウスと野生型
との間で差を見出す事は出来なかった。これらの結果から、S100A1とS100Bは骨格系の形成にとって必
ずしも必要ではないと結論した。我々が以前行ったin vitroでの研究の結果に反してS100a1・S100bダブ
ルノックアウトマウスに明らかな骨格系の異常が見られなかった原因として、他のS100ファミリータン
パクが代償的に発現上昇し、S100a1やS100bの機能を代償している可能性を考えた。これを検証するた
め、野生型およびS100a1・S100bのシングル及びダブルノックアウトマウスの肋軟骨からmRNAを採取
し、マウスで知られている全17種のS100ファミリー遺伝子の発現量を調べたが、S100a1やS100bのノッ
クアウトマウスで有意に発現上昇しているS100ファミリー遺伝子は無かった。しかし、この発現解析に
より、S100a1やS100bのノックアウトの有無に関わらず、軟骨組織で高発現しているサブタイプが複数
存在すると判明した。これらの軟骨細胞で高発現しているサブタイプのうちS100A2、S100A4、及び
S100A11をATDC5細胞で過剰発現させて分化誘導後した所、コントロールに比してアリザリンレッドS
の染色性が低下し、また、アルカリフォスファターゼ活性が低下しており、これら3つのサブタイプに
はS100A1・S100B同様の肥大分化・石灰化を抑制する作用があると考えられた。以上より、石灰化を抑
制する作用のあるS100A1・S100B以外のS100のサブタイプが軟骨細胞で発現しており、このため、肥大
分化や石灰化を抑制する作用のあるS100a1やS100bをノックアウトしても、骨格系の表現型が出なかっ
た可能性があると考えた。 
次いで、S100A1・S100Bの、軟骨変性病態への関与について解析を行った。我々は以前行った研究で、
S100A1・S100Bがin vitroでATDC5の肥大分化・石灰化を抑制する作用を持つ事を発見している。この事
と、変形性関節症病態の進展に関節軟骨の肥大分化様の変化が関与している事とを併せ、S100A1・S100B
が肥大分化抑制作用を介して変形性関節症に対し抑制的に作用している可能性が考えられた。この仮説
をマウス変形性膝関節症モデルによるin vivo解析で検証した。野生型とS100a1ノックアウト、野生型と
S100bノックアウト、及びS100a1ノックアウトとS100a1・S100bダブルノックアウトの3組について、変
形性関節症進行の程度を術後12週で比較した。その結果、S100a1ノックアウトマウスでは、野生型に比
して有意に変形性関節症が進行していた。S100bノックアウトマウスやS100a1・S100bダブルノックアウ
トマウスでは、それぞれの対照群に比して変形性関節症の進行度に有意な差は無かった。この事から、
S100A1とS100BのうちS100A1のみが変形性関節症病態に保護的に作用している可能性があると考え、
S100A1についてのみ更に解析を進める方針とした。 
変形性関節症病態にある関節軟骨でのS100A1の発現を解析するため、マウス膝関節の組織切片に対して
抗S100A1抗体による組織免疫染色を行った。無処置の膝関節では、関節軟骨全層・全横位で染色が見ら
れ、S100A1はユビキタスに発現していると考えられた。変形性関節症手術を行った膝関節では、本手術
で変性が誘導される荷重部の軟骨細胞で、継時的にS100A1の染色性が低下していた。この事から、
S100A1の発現の強さと軟骨変性の進行度とは負の相関を持つと考えられた。 
軟骨分化のmaster regulatorとして知られているSOX9は、in vitroでS100A1を発現誘導すると知られており、
かつ、関節軟骨変性に対して保護的に作用している事も報告されている。そのため、S100A1の関節軟骨
保護作用にSOX9が何らかの関与をしている可能性があると考え、SOX9についても変形性関節症誘導手
術を行ったマウスの膝関節を用いた免疫染色によって発現を解析した。SOX9は変形性関節症導入手術
後2週では、関節軟骨の比較的浅い層で発現が見られたが、比較的軟骨変性が進行している荷重部では
発現が弱かった。術後4週、8週と軟骨変性が進むにつれて、荷重部で相対的に発現が低いという空間的
パターンを維持したまま、術後早期に比して発現が低下していき、術後12週ではほぼ発現が見られなく
なった。以上より、S100A1とSOX9は、変形性関節症の進展とともに、軟骨変性の強い部位から発現が
低下していくという類似した発現パターンを示しており、S100A1の関節軟骨保護作用にSOX9が関与し
ている可能性があると考えられた。 
S100a1ノックアウトマウスで変形性関節症が有意に進行したメカニズムをin vitroで解析した。マウス関
節軟骨細胞に対しsiRNAを投与してS100a1をノックダウンした所、Sox9、及びその下流で働く主要な軟
骨マトリクス分子であるCol2a1、AggrecanのmRNAの発現が低下していた。それに加え、関節軟骨表面
での潤滑を司るPrg4 (Proteoglycan4)のmRNAも発現低下していた。SOX9についてはタンパクレベルで
も発現が低下していた。これらから、S100A1は関節軟骨に対するpro-anabolicな作用を介して、軟骨変性
に対して保護的に働いている可能性が示唆された。 
以上までに行ったS100a1ノックアウトマウスを用いたin vivo解析、及びS100a1のsiRNAによるノックダ
ウンを行ったin vitro解析によってS100A1が軟骨変性に対して保護的に作用している可能性が示唆され
たため、逆に、S100A1の細胞内での過剰発現及び細胞外からの投与により軟骨変性に対する抑制作用が
得られる可能性があると考え、in vitroでの検証を行った。マウス関節軟骨細胞に対しヒトS100A1遺伝子
をコードするアデノウイルス (Ax-S100A1)を投与した所、Sox9、Col2a1、AggrecanのmRNAの発現上昇
が見られた。一方、Prg4の発現には変化が無かった。SOX9については更にタンパクレベルでも発現上昇
が確認された。続いて、マウス関節軟骨細胞に対しヒトリコンビナントS100A1タンパク(recombinant 
human S100A1, rhS100A1)を0 ng/ml、100 ng/ml、及び1 μg/mlの3段階の濃度で投与した所、Sox9、Col2a1、
AggrecanのmRNAの発現がrhS100A1の濃度依存性に段階的に減少し、1 μg/mlでは発現低下は有意であ
った。Prg4の発現は、100 ng/mlでは有意に低下していたが、1 μg/mlでは変化が無かった。SOX9につい
ては、タンパクレベルでもrhS100A1投与で発現が低下していた。S100タンパクには細胞内作用と細胞外
作用があるが、細胞内作用と細胞外作用の比率は、アデノウイルスでの過剰発現では相対的に細胞内作
用寄りとなり、リコンビナントタンパクの投与では相対的に細胞外作用寄りとなると考えられる。この
事を踏まえると、S100A1の過剰発現は、Sox9、Col2a1、Aggrecanの発現を細胞内作用としては亢進し、
細胞外作用としては抑制すると推定された。Prg4については、これら３つの遺伝子とは異なる制御を受
けていると考えられ、低濃度のS100A1の細胞外作用により発現が抑制されると推定された。抗S100A1
抗体によってS100A1の細胞外作用を抑制した上でAx-S100A1を投与した際は、IgGとAx-S100A1を投与
した群に比して、Sox9がmRNAレベルでもタンパクレベルでも発現上昇していたが、この事は、S100A1
が細胞内作用としてはSox9の発現を亢進し、細胞外作用としてはSox9の発現を抑制するという仮説を支
持する。 
本研究の結果から、S100A1とS100Bは骨格系の発生には必ずしも必要で無いが、S100A1は細胞内作用と
してのpro-anabolicな遺伝子の発現上昇を介して、軟骨変性病態に対して保護的に作用すると考えられた。
臨床応用へ向けた今後の研究の進展に期待したい。 
 


S100A1・S100Bの骨格系組織の発生及び関節軟骨の維持に対する機能の解析

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S100A1・S100Bの骨格系組織の発生及び関節軟骨の維持に対する機能の解析

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