学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 片岡 一則, 東京大学教授 津本 浩平, 東京大学准教授 CABRAL Horacio, 東京大学准教授 宮田 完二郎, 東京大学教授 吉田 亮University of Tokyo(東京大学

Hayashi Kotaro

林 光太朗

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論	文	の	内	容	の	要	旨	
	
	
	
Preparation	and	characterization	of	unit	polyion	complexes	with	siRNA	utilizing	
PEG-block-poly(amino	acid)s	
(PEG-ポリアミノ酸ブロック共重合体を用いたsiRNA最小単位会合体の調製と	
その機能評価)	
	
									 	 	 氏	 	 名			林	 光太朗	
	
	 約21塩基対の短い二本鎖RNAであるsmall interfering RNA (siRNA)は、ほ乳類細胞に対して
RNA干渉を誘起することが広く知られている。RNA干渉とは、細胞質内においてsiRNA自
身と相補的な塩基配列をもつメッセンジャーRNA (mRNA)を分解する機構であり、その配列
特異性からRNA干渉のトリガーとなるsiRNAは、難治性疾患の原因遺伝子を特異的に抑制す
る核酸医薬として注目されている。しかし、負に帯電したsiRNA単体は、生体内に豊富に存
在する核酸分解酵素により迅速に分解されること、また、同じく負電荷を帯びた細胞膜と
反発して細胞に取り込まれないことから、その効果を十分に発揮できない。このため、siRNA
を標的細胞まで安定に送達するデリバリーキャリアの開発がsiRNAの医療展開に向けて必
要となる。 
	 キャリアデザインとして、負電荷をもつsiRNAとカチオン性高分子との間でポリイオンコ
ンプレックス(PIC)を形成させ、ナノ粒子化する手法が広く受け入れられている。siRNAの
負電荷を中和することにより細胞膜との静電反発を防ぎつつ、ナノ粒子に封入することに
より酵素分解から保護することが期待される。こうしたPICの形成過程に関する研究を通じ
て、電荷を中和するのに必要な最小単位のPIC (unit PIC, uPIC)がまず形成され、それが二次
会合することによってPICミセルなどの多分子会合体が構築されることが報告されている。
uPICは、多分子会合体に比べてサイズが小さいため、血管密度が低く厚い間質で覆われた
線維性の腫瘍組織に対して優れた組織浸透性を示すキャリアになることが期待されるが、
uPICを用いた核酸キャリアは報告されていない。本研究では、siRNAをポリアニオンとする
uPICの形成条件を検討し、そのsiRNAキャリアとしての機能を評価する。とりわけ、全身投
与型siRNAキャリアとしての展開には生体内における安定性が第一に求められる。よって、
血流中で優れた安定性を有するuPICの構築に向け、ポリエチレングリコール(PEG)-ポリアミ
ノ酸ブロック共重合体の構造最適化を行うと共に、その構造がuPICの会合状態および安定
性にどの様な影響を与えるかを詳細に評価した。 
	 まず、カチオン性ブロック共重合体と二本鎖RNAであるsiRNAと一本鎖RNAとのPIC形成
を比較することにより、uPICの形成条件を検討した。ポリカチオン鎖として天然の塩基性
アミノ酸であるL-リシンのポリマー(PLL)を選択し、分子量の異なるPEGを用いてブロック
共重合体PEG-PLLを合成した。この際、PLLの正電荷数(=重合度(DP))はsiRNAの負電荷(リ
ン酸基)数と同数である40とした。得られたPEG-PLLを用いてsiRNAもしくは一本鎖RNAと
の間でPICを形成させ、その会合状態を蛍光相関分光法(FCS)と分析超遠心(AUC)を用いて解
析した。一本鎖RNAより調製されるPICでは、低濃度では粒子径が6~15 nmのuPICが形成さ
れるが、ある濃度を越えると30~70 nmの粒子径を有する多分子会合体(PICミセル)を形成す
ることが示された。一方、siRNAから調製されるPICでは、PEGの重なり濃度(C*)に近い高
濃度においても多分子会合体は形成されず、uPICが選択的に得られることが確認された。
この違いは、siRNAの円筒状で剛直な二本鎖構造のために多分子会合によるエンロピー利得
が得られないためであると考察された。また、PEGの分子量を2,000から42,000まで変化させ
ても同様のPIC形成挙動が見られたことから、uPICの二次会合にはブロック共重合体のPEG
の分子量よりも核酸の構造が強く影響していることが示唆された。 
	 次に、ポリカチオン1分子当たりの正電荷数がsiRNAとのPIC形成に影響を与えると考え、
異なる重合度のPLL鎖を含むPEG-PLLを用いてPICを調製し、その構造解析を行った。この
際、siRNAが40の負電荷を有することに着目し、PLLの正電荷数をその1/2倍〜2倍となるDP 
= 20, 30, 40, 60, 80となるようにPEG-PLLを合成した。合成したPEG-PLLをsiRNAと混合し、
得られたPICにおけるsiRNAとPEG-PLLの会合数(AN)をそれぞれAUCとFCSを組み合わせる
ことにより算出した。その結果、PEG-PLLの正電荷数がsiRNAの負電荷数の1/2倍、等倍、2
倍となるDP = 20, 40, 80のときそれぞれ、(ANPEG-PLL, ANsiRNA) = (2, 1), (1, 1), (1, 2)となり、電
荷が中和された単一のuPICが形成することが明らかとなった。一方、siRNAの電荷の約数で
も倍数でもないDP = 30, 60のときは、(ANPEG-PLL, ANsiRNA) = (1.2, 1), (1.3, 2)となり、PEG-PLL
の会合数が整数とならず、二種類以上のPICが系の中に存在していることが示唆された。こ
れらの結果より、単一のuPICを選択的に調製するためにはブロック共重合体の正電荷数を
siRNAの負電荷の約数、同数、または倍数に調節することが重要であると考えられる。 
	 これまでに調製方法を確立したuPICについて、siRNAキャリアとしての機能を検討した。
まず、siRNA uPICの生体内での安定性の指標となる血中滞留性について、PEG-PLLのPEGお
よびPLL重合度の影響を調査した。PLL重合度に関しては、DP = 20と40の比較より、2分子
のPEG-PLLからなるuPICが長い血中半減期を有し、高い安定性を示すことが明らかになっ
た。これは、1つのuPIC中に含まれるPEGの本数が増加したことで、生体成分との非特異的
相互作用が抑制された(“ステルス効果”が強まった)ためであると考えられる。一方、PEGに
ついては、その分子量の増加および分岐型PEGによる本数の増加に伴い、uPICの血中半減期
が延長されることを見出した。これは高分子量のPEGまたはより多くのPEG鎖による高いス
テルス効果によるものであると考えられる。また、uPICと過剰量のPEG-PLLを同時投与す
ることにより、血中滞留性が劇的に向上することも明らかになった。蛍光共鳴エネルギー
移動(FRET)を用いたin vitroおよびin vivoの解析により、この血中での安定性向上には、uPIC
中のPEG-PLLと過剰のPEG-PLLとの置きかわりが関与していることが示された。最適化さ
れたuPICは、リポソーム製剤などが到達しづらいとされる間質の多い膵臓がん(BxPC3)の皮
下移植モデルマウスにて、効率良く腫瘍組織へと集積することが明らかになった。さらに、
同モデルマウスにて、治療用siRNAを搭載したuPICの投与により、非治療用siRNA搭載uPICの
投与や生理食塩投与に比べ、有意に高い遺伝子抑制作用および抗腫瘍効果が得られた。以上の
ことから、uPICがsiRNAキャリアとして高い将来性を有することが明らかになった。 
	 さらに、uPICにおけるポリアミノ酸構造の影響を検証し、siRNAキャリアとしての改善を
試みた。siRNAの構造(具体的にはリン酸基の配置)に空間的にマッチするカチオン性ポリア
ミノ酸が高い安定性を有するuPICを形成すると仮説を立て、リシンと同じく一級アミンを
有するカチオン性ポリアミノ酸として側鎖スペーサー長が少しずつ異なるPEG-ポリ(アミ
ノアルキル-L-グルタミド) (PEG-PLG(ACn))およびPEG-ポリ(-L-オルニチン) (PEG-PLO)を、
ポリアミノ酸重合度を20に固定して合成した。合成されたPEG-ポリアミノ酸とsiRNAとを
混合してPIC形成を行い、AUCとFCSを通じてその会合数と安定性を比較した。その結果、
側鎖構造の異なるポリカチオン鎖を用いた場合でもPEG-PLLと同様に、(ANpolymer, ANsiRNA) = 
(2, 1)となるuPICの形成が確認され、ポリカチオン構造に関わらずuPICが形成されることが
示された。さらに、これらのuPICのポリアニオンとの置き換わりに対する耐性を比較した
ところ、側鎖スペーサー長が短いポリアミノ酸ほど高い耐性を示すことが見出された。こ
れは、スペーサー長がsiRNAの二本鎖らせん構造のmajor grooveにフィットし、siRNAとブロ
ック共重合体の結合が強くなったためと考察された。続いてuPICの血中滞留性を評価した
ところ、ポリアニオンに対する耐性が最も高かったPEG-PLOから調製されるuPICが最も長
い血中半減期を示した。また、PEG-PLOからなるuPICは、より少量のポリマー添加の条件
下でも優れた血中滞留性を示したことから、siRNAキャリアとして実用化に適していることが
わかった。 
	 以上より本研究は、siRNA搭載uPICの選択的な調製条件を確立すると供に、ブロック共重
合体のPEGおよびポリカチオン構造の最適化を通じて新たなsiRNAキャリアプラットフォ
ームを創出した。 
 


PEG-ポリアミノ酸ブロック共重合体を用いたsiRNA最小単位会合体の調製とその機能評価

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PEG-ポリアミノ酸ブロック共重合体を用いたsiRNA最小単位会合体の調製とその機能評価

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