学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 中内 啓光, 東京大学教授 北村 俊雄, 東京大学教授 東條 有伸, 東京大学准教授 佐藤 均, 東京大学准教授 田中 稔University of Tokyo(東京大学

Ieyasu Aki

家保 有希

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論文の内容の要旨 
 
組み換えアルブミンを用いた培養系による造血幹細胞の増殖制御因子の探索 
家保有希 
 
<背景と目的> 
 造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cells; HSCs)は骨髄中のニッチと呼ばれる微小環境に存在してい
ると考えられており、一生涯にわたり生体に必要な全血球細胞を供給している。骨髄ニッチの 1
つとしてシュワン細胞を含む血管性ニッチが挙げられるが、血管周囲では様々な液性因子が協調
して HSCs の未分化性を維持していると考えられている。現在までに、これら骨髄ニッチの知見
から、Stem Cell Factor (SCF)や Thrombopoietin (TPO)などの液性因子刺激における HSCsの増幅に
関する研究が、数多くの研究者によって行われてきた。しかし、体外において未分化性を維持し
つつ HSCs を増幅させることは未だ困難な状況である。また、1つの研究室で得られた知見が別の
研究室では再現が困難であるという事例が、「実験条件の違いによるもの」として問題視されてこ
なかった。 
私は、培養系でウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum; FBS)やウシ血清アルブミン(Bovine Serum 
Albumin Fraction-V; BSA-FV)を用いることで得られた実験結果こそが、再現が困難な状況の一因で
あると仮説を立てた。そこで本研究では、無血清培地に BSA-FV を添加している現在の培養系の
問題点を特定し、不確定な要素を含む BSA-FV を用いない、新たな培養系の構築を試みた。更に、
構築した培養系を用いて、生体外における HSCsの維持因子の同定を行った。 
 
<方法と結果> 
1. HSCsの増殖能および骨髄再構築能に影響を及ぼす BSA-FVの不均一性 
まず、製造ロットの異なる 15種類の BSA-FV を用いてコロニーアッセイを行い、各 BSA-FV で
培養した HSCsのコロニー形成能について調べた。その結果、5種類の BSA-FV では、他 10種の
BSA-FV 使用時と比較して、コロニー形成能が低下していた(図 1A)。次に、コロニーを形成した
10 種類の BSA-FV を対象に HSCs を 1 週間培養後、競合的骨髄移植を行い、HSCs の骨髄再構築
能を評価した。解析の結果、培養に用いた BSA-FV の製造ロットが異なることで、HSCs の骨髄再
構築能に大きな差が確認された(図 1B)。移植 12 週後の末梢血のキメリズムは、#1 のように 50%
以上を示すものがある一方、#15 のように生着が殆ど検出できないロットも存在した。このよう
に、培養に用いた BSA-FV の製造ロットが異なることで、培養した HSCs の増殖および骨髄再構
築の維持能力に大きな差があることが示された。 
 
 
  
2. 組み換えアルブミンタンパク質を用いた培養系の構築 
 BSA-FV の製造ロットが異なることにより HSCs の骨髄再構築能の実験結果が変わるという事
実から、今日の HSCs 培養系では信頼できる知見を得ることは困難であると考えた。そこで私は、
BSA-FV 培養系に代わり、BSA-FV を用いない、基準となる新たな培養系の構築を試みた。まず
BSA-FVを添加せず培養実験を行ったが、
残念ながらHSCsのコロニーは形成され
なかった。そこで、遺伝子組み換え技術
を用いた非動物性組み換えアルブミン
タンパク質(Recombinant Serum Albumin; 
RSA)に着目した。 
 BSA-FV#8とRSA使用時のHSCsのコ
ロニー形成および in vitro 増殖能につい
て解析したところ、両者に有意な差は認
められなかった。更に、RSAを用いて 1 図 2. RSAを用いた競合的骨髄移植(12 週) 
(B) 図 1. BSA-FVの不均一性 
(A) single cell colony assay 
(11日間)  
(B)競合的骨髄移植 12週後
の末梢血における生着率 
(A) 
コ
ロ
ニ
ー
形
成
の
割
合
(%) 
生
着
率 
(%) 
   
生
着
率 
(%
) 
週間 HSCs を培養し移植を行って骨髄再構築能について評価したところ、BSA-FV#8と同等程度の
キメリズムを示した(図 2)。このように、組み換えアルブミンは BSA-FV#8 と同じように HSCs の
実験培養系に用いることが可能であると確認された。これより、不確定要素を含む BSA-FV を用
いない、基準となる培養系を確立することが出来た。 
 
3. HSCsの維持因子の探索における組み換えアルブミンを用いた培養系の有用性 
 次に、組み換えアルブミンを用いた培養系を利用して HSCs の維持因子の探索を行った。HSCs
の DNAのマイクロアレイデータをもとに、HSCsの細胞表面に受容体が存在している因子の候補
を絞った。そして、候補因子を添加して HSCs を培養した後、骨髄移植を行って HSCs の能力を評
価した。その結果、IL-1を添加した際に HSCsの骨髄再構築能は有意に増加した(図 3A)。 
 
 
 
4. BSA-FVに含まれる維持因子の探索 
私は BSA-FV#1 を用いて培養した HSCs の骨髄再構築能が高いことを疑問に思い、BSA-FV#1
特異的に含まれる微量タンパク質の同定を試みるため、組み換えアルブミンを用いた培養系を利
用して解析を行った。まず、BSA-FV#1、#8、#15から大部分のアルブミンを除去した後、網羅的
高速液体クロマトグラフィー/質量分析解析を行った。その結果から、BSA-FV#1 特異的なタンパ
ク質として、ヘモペキシン(Hemopexin; HPX)を見出した(図 3B)。 
次に、他の BSA-FVでも HPXが検出されるか否か調べるため、ロットの異なる 8種類の BSA-FV
を用いてウエスタンブロット解析を行った。すると8種類中3種のBSA-FVでHPXが確認された。
これらの BSA-FV を用いて HSCs を 1週間培養し骨髄再構築能を評価した。すると、HPX が検出
図 3. RSA培養系を用いた候補因子の探索 
(A) IL-1添加培養時における HSCs 骨髄再構築能の推移 
(B) HPX添加培養後の競合的骨髄移植(移植後 12週の末梢血における生着率) 
生
着
率 
(%
) 
生
着
率 
(%
) 
(A) (B) 
された 3種類の BSA-FV では、コントロール(RSA)よりもキメリズムが高く、培養した HSCsの骨
髄再構築能と HPXには相関関係があると確認された。 
 過去の報告では、HPXは生体内で主に肝臓、肺、神経系で発現していると報告されている。ま
た、神経系細胞であるシュワン細胞は骨髄ニッチの 1 種であると報告があることから、私は骨髄
中のシュワン細胞において HPX が発現しているのではないかと考えた。そこで、HPX 抗体を用
いて骨髄切片の免疫染色を行い、神経細胞と HPXの局在について解析した。その結果、両者は共
局在もしくは非常に近接して存在していることが明らかになった。よって、HPXは生体内でも骨
髄ニッチに存在し、HSCsの未分化性維持に寄与している可能性があることが示唆された。 
 
<考察> 
 今日 HSCs の培養に広く用いられている BSA は、エタノール分画法で精製された”BSA-FV”で
あり、生理的構造と機能を維持しているものの、血清アルブミン以外の微量タンパク質を多く含
んでいた。これらの微量タンパク質によって、培養した造血幹細胞の増殖能、骨髄再構築能に差
異が生じてきたと考えられる。本研究では、BSA-FV ではなく組み換えアルブミンを用いること
によって、実験培養系の不確定要素を軽減した基準となる培養系を構築することが出来たと考え
る。 
 更に、組み換えアルブミンを用いた培養系を利用して、IL-1及び HPX という HSCs の新たな
維持因子を見出した。IL-1は、HSCsに及ぼす影響について先行研究で意見が割れていた。意見の
不一致の原因として、先の研究では FBS や BSA-FV を用いた培養系で解析していた点が考えられ
る。今回の組み換えアルブミンを用いた培養系を利用することで、FBS 及び BSA-FV に含まれる
不確定要素を排除したうえで、IL-1が HSCsに及ぼす影響を評価することが出来た。 
また、BSA-FV に含まれる維持因子として HPXを発見した。HPXは、生体内で血中の遊離ヘム
に最も高い結合性を示す糖タンパク質である。HPX ノックアウトマウスの造血系には異常がない
と過去に報告されており、組み換えアルブミンを用いた培養系を利用しなければ、HPX を HSCs
の維持因子として検出することは出来なかったであろう。驚いたことに、培地の成分にはヘムが
含まれていないにもかかわらず、HPX 添加によって培養した HSCsの ROSレベルの上昇は抑制さ
れた。HPX は、培地中で死細胞由来の遊離ヘムに結合し、生細胞への ROS 傷害を抑制している
のかもしれない。更に、HPX添加のみでは、高いキメリズムを示す BSA-FV と同等の骨髄再構築
能を維持することは出来なかった。よって、BSA-FV の製造ロットによっては、HPX 以外の維持
因子を含有している可能性が高い。 
これらの結果より、組み換えアルブミンを用いた培養系は、培養実験系の再現性向上という観
点および HSCs の維持因子の新たな探索系という点から、非常に重要であると思われる。 


組み換えアルブミンを用いた培養系による造血幹細胞の増殖制御因子の探索

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組み換えアルブミンを用いた培養系による造血幹細胞の増殖制御因子の探索

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