学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : (主査)東京大学教授 徳永 勝士, 東京大学准教授 甲賀 かをり, 東京大学講師 浦野 友彦, 東京大学講師 加藤 元博, 東京大学准教授 久米 春喜University of Tokyo(東京大学

Miyasaka Aki

宮坂 亞希

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論文の内容の要旨 
論文題目  子宮体癌における PARP(Poly ADP-ribose polymerase)阻害剤及び 
放射線照射の抗腫瘍効果に関する検討 
 
氏名 宮坂 亞希 
 
[序論] 
 新たな治療法の選択肢として分子標的薬の開発が進んでおり、婦人科癌の治療において
も、従来の手術・化学・放射線療法(IR: Ionizing radiation)以外の治療法の確立が期待されて
いる。しかしながら、子宮体癌で臨床応用されている分子標的薬は未だ存在しない。分子
標的薬は癌の生物学的特徴をもとに開発された薬剤であるが、バイオマーカーが明確でな
い薬剤も存在する。PARP ( poly ADP-ribose polymerase ) 阻害薬は、DNA の一本鎖切断修復
を阻害する薬剤であり、DNA 二本鎖切断の蓄積を誘導するため、DNA の相同組換え修復 
(HR: Homologous Recombination) の障害を来たした癌細胞において、殺細胞効果が期待され
る。現在、乳癌・卵巣癌を中心に、特に BRCA1/2 変異陽性例に対して臨床試験が進んでい
る。HR には PTEN を含めて様々な分子の関与が報告されており、PARP 阻害薬において、
BRCA1/2 以外のバイオマーカーが存在する可能性がある。また、放射線照射も DNA 損傷を
起こすことを通して、殺細胞効果をもたらす治療法であり、PARP 阻害薬と共通性がある。 
 本研究では、子宮体癌における PARP 阻害薬の有効性、PTEN 変異が PARP 阻害薬のバイ
オマーカーとなりうるか、IR の感受性と相関する因子の解明、IR により活性化されるシグ
ナル伝達経路の同定、IR による抗腫瘍効果を増強する分子標的薬とその効果に関わる分子
の解明を目的とした。 
 
 [方法] 
(1) 子宮体癌細胞株における PARP 阻害薬の抗腫瘍効果  
子宮体癌 16 種類の細胞株を用いて検討を行った。cDNA を用いて、PCR-ダイレクトシーク
エンス法にて PTEN の変異を検索した。Western blot を行い、PTEN の発現を調べた。全 16
株について olaparib を添加し、clonogenic assay により細胞増殖抑制効果を評価した。SF50
値（コロニーの数が半数に低下する濃度）を算出し、PTEN の変異、および PTEN の発現と
感受性との相関の有無を検討した。HEC-6 （PTEN 欠損株）にレトロウィルスベクター
(pFB-NEO)を用いて野生型 PTEN を安定導入した（HEC-6-PTEN）。HEC-6 と HEC-6-PTEN
を用いて olaparib を添加し、clonogenic assay により、細胞増殖抑制能を評価した。またこの
両細胞株について、DNA 二本鎖切断部位の ɤ-H2AX と二本鎖切断修復部位を示す RAD51
の fociの数を細胞免疫染色によって評価した。さらに PTENの細胞周期に与える影響を Flow 
cytometry を用いて調べた。放射線照射(IR: Ionizing radiation)についても、同様に PTEN 発現
の有無により、ɤ-H2AX、RAD51 の foci 数や、細胞死の比率が異なるか、検討を行った。 
 
 (2) 子宮体癌細胞株における IR の抗腫瘍効果 
子宮体癌 8 株の細胞株に IR (2~6Gy) を加えた後、clonogenic assay を行った。TP53, PTEN, 
KRAS, PIK3CA の遺伝子変異と感受性との相関を調べた。western blot により、IR によって
PI3K 経路や MAPK 経路が活性化されるかを、同経路の蛋白のリン酸化（AKT, ERK)レベル
により評価した。続いて MAPK 経路阻害薬、もしくは PI3K/mTOR 経路阻害薬を IR と併用
し、clonogenic assay にて IR単独での効果と比較した。さらに MAPK 経路、PI3K/mTOR 経
路の下流にあたる、HIF-1α/VEGF-A の発現について western blotting、Quantitative RT-PCR を
用いて検討した。 
 
[結果] 
(1) 子宮体癌細胞株における PARP 阻害薬の抗腫瘍効果 
16 株において、olaparib 添加における clonogenic assay では、SF50 は 8 ~2,500 nM であった。
このうち 4 株 (25%) では SF50 値が 100 nM 未満であり、高い感受性を示した。その一方、
4 株(25%)では、SF50 値が 1,000 nM 以上と低感受性であった。このように olaparib 感受性は
個々の細胞株で大きく異なることが示された。PTEN の変異は 16 株中 12 株（75％）と高頻
度に認めた。12 株の PTEN 変異株のうち 8 株では PTEN の発現消失を認めた。PTEN 変異・
発現の有無は、Olaparib の SF50 値と有意な相関を示さなかった。また、RAD51 は全ての株
で発現がみられたが、PTEN と RAD51 の発現についても相関はみられなかった。さらに、
HEC-6 と HEC-6-PTEN を用いて Olaparib の効果を比較したが、SF50 値 (1,500 nM)、細胞周
期への影響 (Sub-G1, G2/M 比の上昇) のいずれも有意な差を認めなかった。細胞免疫染色に
よる ɤ-H2AXとRAD51の foci数の評価においても、両細胞株間で有意差はみられなかった。
PTEN 野生型株(HEC-1B, HEC-50B)で PTEN 発現を si RNA にてノックダウンし、また PTEN
発現欠損株 (AN3CA)に野生型 PTEN を強制発現させたが、olaparib の感受性に有意な差は
認められなかった。以上より、子宮体癌の中で Olaparib に高感受性のものが存在すること
が示されたが、効果を予測するバイオマーカーは PTEN非依存性の因子と考えられた。 
 
 (2) 子宮体癌細胞株における IR の抗腫瘍効果 
 8 細胞株に X 線 2~6Gｙを照射して clonogenic assay を行ったところ、D10値（90%の細胞
増殖を抑制する線量）は 2～>6Gy と細胞株毎で感受性が大きく異なっていた。TP53 野生株
3 株では D10値が≦3.1Gy, TP53 変異株 5 株においては D10値≧3.3Gy であり、TP53 変異が IR
の抵抗性と相関することが示唆された。TP53 変異株 5 株は全ての株で PIK3CA に変異を有
し、2 株に KRAS の変異を、3 株に PTEN 変異が存在した。IR 照射した細胞株において、ERK
および AKT のリン酸化の上昇がみられ、MAPK 経路と PI3K 経路がいずれも活性化するこ
とを確認した。また、MAPK 経路に比べ、PI3K 経路の活性化は遅れて生じており、24-48
時間以降で AKT リン酸化の著明な上昇があった。また HIF-1α も時間とともに発現が増加
した。MEK 阻害薬（UO126）または PI3K/mTOR 阻害薬（BEZ235）と IR を併用し、IR 単
独と比較したところ、全ての株で BEZ235 併用により有意な SF50 値の低下（≦2Gy）が認
められたが、UO126 併用では、2 株を除いて併用効果は見られなかった。IR 高感受性であ
った TP53 野生株では、低濃度(50 nM)でも BEZ235 により IR の感受性が増強していた。IR
低感受性であった TP53 変異株では、50-100 nM の BEZ235 添加により、IR の感受性が増強
した。 
 UO126・BEZ235 による MAPK 経路または PI3K 経路の抑制と HIF-1α の発現の相関につ
いて western blot 法で検討したところ、HIF-1α の発現は BEZ235 でのみ抑制された。さらに
UO126・BEZ235 の添加時の VEGF（Vasucular endometrial growth factor）の発現についても、
BEZ235 においてのみ、有意な発現抑制を認めた。HIF-1α の発現抑制と IR の併用により、
sub-G1(細胞死)の比率が IR単独よりも有意に増加した。 
 
 
 [考察]  
 本研究では、子宮体癌において DNA 損傷・修復機序に着目し、PARP 阻害薬 olaparib と
IR による抗腫瘍効果の検討、バイオマーカーの探索、IR の効果を増強する分子標的薬の探
索について解析を行った。 
今回、子宮体癌株のうち、25％では PARP 阻害薬 olaparib に高感受性を示し、25％では低
感受性を示したが、PTEN 変異の有無はそのバイオマーカーとはならなかった。しかし子宮
体癌においても、HR の機能障害を有し、olaparib が有効なものが存在する可能性が示され
た。さらに、子宮体癌では BRCA1/2の変異頻度は低いことが知られており、BRCA1/2や PTEN
以外の因子によって、HR に何らかの機能異常を有するものが存在することが示唆された。
子宮体癌においても、PARP 阻害薬の感受性を予測するバイオマーカーについて更なる検討
が必要である。 
 子宮体癌において IR の効果を予測するバイオマーカーや効果を増強する治療薬は報告が
見られなかった。今回の解析により、子宮体癌における放射線の感受性は TP53 変異が関与
していることが強く示唆された。また、TP53 変異は 5 株すべてで PIK3CA 変異と共存して
おり、PI3K 経路も感受性と関わっている可能性がある。実際に IR によって活性化を受ける
MAPK 経路と PI3K 経路のそれぞれを阻害したところ、PI3K/mTOR 阻害薬(BEZ235)におい
て、IR の効果が強く増強されることが明らかとなった。HIF-1α の発現は BEZ235 により有
意に抑制され、BEZ235 による IR 効果の増強には HIF-1/VEGF 経路の関与が示唆された。以
上より、PI3K/mTOR 阻害薬や HIF-1α/VEGF 阻害薬が IR の効果を高める併用薬として期待
され、今後の臨床応用につながる可能性が示唆された。 
 
 
 


子宮体癌におけるPARP(Poly ADP-ribose polymerase)阻害剤及び放射線照射の抗腫瘍効果に関する検討

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子宮体癌におけるPARP(Poly ADP-ribose polymerase)阻害剤及び放射線照射の抗腫瘍効果に関する検討

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