学位の種別:課程博士University of Tokyo(東京大学

Hayama Tomonari

葉山 智工

UTokyo Repository

博 士 論 文 （要 約） 
 
免疫不全動物を用いた異種異所発生による 
始原生殖細胞からの生殖腺様組織誘導 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
葉 山 智 工 
  
1 
 
論文の内容の要旨 
 
 
論文題目  免疫不全動物を用いた異種異所発生による 
始原生殖細胞からの生殖腺様組織誘導 
 
     氏名    葉山 智工 
 
 
 
研究の背景 
不妊症の治療法は年々進歩しているがその一方でそうした治療の恩恵にあずかるこ
との出来ない絶対不妊の患者が注目されている。Turner 症候群などの性分化異常
（disoder of sex development: DSD）に合併する配偶子形成不全の患者は現在の不妊治療
でその遺伝子を引き継いだ子どもを得ることは不可能である。こうした患者は卵巣内に
原始卵胞が無く、原始卵胞を取り出して試験管内卵胞発育（in vitro Growth: IVG）を行
うことは出来なく、子供を得るためには何らかの方法で卵を作成する必要性がある。 
卵の起源となる始原生殖細胞（primordial germ cell：PGC）はマウスでは胎生 7.5 日齢、
ヒトでは妊娠 5 週（胎生 3 週）胚 Epiblast 中に発生する。移動、胎児性腺（生殖隆起）
内への定着、増殖を経てから卵原細胞、卵母細胞へと分化する。卵は第一減数分裂複糸
期で一旦停止し、卵核胞（germinal vesicle：GV）期の状態で思春期以降まで維持される。
胎児期に作られた卵母細胞は原始卵胞の形で保存され生涯、排卵されるだけで、新生す
ることは無いと考えられている。 この卵を作成する方法の一つとして多能性幹細胞か
らの誘導が注目されている。 
多能性幹細胞を用いた再生医療研究は iPS細胞（induced pluripotent stem cell：iPSC）
が報告されてから国内外で加速され、ES細胞（embrnic stem cell: ESC）や iPSCから様々
な細胞・組織の誘導が試みられ、その機能の解析が行われている。生殖細胞への分化誘
導も 2000 年代前半には bone morphogenetic protein 4（BMP4）などを用いた PGC 誘導の
報告がされ、続いて 2006 年には Nayernia らがマウス ESC から PGC そして 1 倍体精子
細胞を分化させ、顕微受精により産仔に至ったと報告した。その後、2011 年には Schöler 
HR.らによりマウス胎児 PGC における遺伝子発現パターンは ESC などの多能性幹細胞
と近いことが報告されれ、2012 年には Saitou らが Stella、Blimp1、Prdm14 などの PGC
で発現している遺伝子のプロモーター下流に蛍光タンパク質を組み込んだレポーター
マウスを用いてマウス多能性幹細胞からの機能的雄・雌の PGC 誘導法を報告した。こ
の報告では多能性幹細胞から雄・雌のどちらの生殖細胞の誘導にも成功し、また産子も
正常に発育している。このようにマウスでは機能的な PGC様細胞（PGC-like cell：PGCLC）
2 
 
が多能性幹細胞から分化誘導が可能になった。 
この新たな技術はヒトの不妊治療は元より、絶滅危惧種の種の保存などへ応用される
ことが期待されるが、一方で、実際にこの方法をマウス以外の動物種に適応し、生殖細
胞を得る為には in vitro で誘導した PGC を異種の動物に移植し、性腺様構造を作成しな
ければならない。 しかしながら、これまでに PGC を異種の動物に移植し、性腺様構
造を作成した例は無く、異種体内で PGC が性腺様構造を構築できるかは明らかではな
い。 
そこで、私の研究は、マウスとラットという異種動物を利用し PGC の異種間移植に
よる性腺様構造作成およびその性腺様構造より得た生殖細胞を成熟させ産仔を得るこ
とで生殖細胞再生の小動物モデルを作成し、proof of concept（POC）を確立することを
目的とした。 
  
方法 
１、ラット PGC の免疫不全マウスへの移植によるラット性腺様構造の構築： 胎生
14.5 の雌ラットより減数分裂を起こしていない後期 PGC を採取し、免疫不全マウス
（NOD-SCID マウス又は NOG マウス）の同所または腎被膜下に移植した。胎児性腺間
質細胞との共移植の方法は胎児生殖隆起全体を腎被膜下に移植する単純移植法と Shen
らの報告した酵素で単一細胞に分離させ、再び凝集させる再凝集法を採用した。 次に
卵巣様組織の組織学的な検討を行う為に得られた卵巣様組織の組織染色を行い、さらに、
卵巣組織としての機能を検定する為に、赤色蛍光タンパク質である tdTomato の蛍光を
発現するラット胎児生殖隆起より卵巣様組織を作成し F344 ヌードラットに移植して腟
垢検査、交配試験を行った。 
 
２、マウス PGC の免疫不全ラットへの移植によるマウス性腺様構造の構築： 緑色
蛍光タンパク質であるGFPを全身で発現するGFPマウスの胎生 12.5の雌より減数分裂
を起こしていない後期 PGC を採取し、再凝集法により去勢した免疫不全ラット
（IL-2gKOラット）の腎被膜下に移植した。 次に卵巣様組織の組織学的な検討を行う
為に得られた卵巣様組織の組織染色を行い、さらに、その卵巣様組織から得られた生殖
細胞の機能を調べる為に試験管内卵成熟(in vitro maturation：IVM)により成熟能を解析し、
受精可能になった卵に対しては卵細胞質内精子注入法（intracytoplasmic sperm injection： 
ICSI）を行った。 
 
結果および考察 
１、ラット PGC の免疫不全マウスへの移植によるラット性腺様構造の構築：  
ラット PGC を単純移植法または再凝集法で NOD-SCID マウスまたは NOG マウスの腎
皮膜下に移植後 28 日目に観察したところいずれのレシピエント、移植方法でも性腺様
3 
 
組織の形成が認められた。しかし再凝集法で NOD-SCID マウスに移植した場合は瘢痕
所見や拒絶が観られた。 
また卵巣間質への同所移植と腎被膜下への異所移植の二通りを比較したところ、GV卵
を採卵可能な卵巣組織の生着率は異所移植で 84％（37/44）あったのに対して同所移植
では 0％（0/7）であり、検鏡にて異種卵胞を確認することが出来たが採卵は不可能であ
った。  
次に、得られた卵巣様組織から組織標本を作成し検鏡観察したところ、ヘマトキシリン
エオジン染色標本では、NOD-SCID マウス、NOG マウスのいずれでも卵胞を伴う卵巣
様組織を認めた。免疫染色では NOG マウス由来の卵胞様構造に卵細胞のマーカーであ
る MVH、Stella陽性の卵胞が認められた。得られた卵巣様組織より採取した GV 期卵様
細胞(GV-OLC)と、正常卵巣組織由来 GV 期卵における遺伝子発現パターンを RT-PCR
で解析したところ両者の発現パターンは非常によく似ていた。 
さらに、ラット胎児生殖隆起より作成した卵巣様組織をヌードラットに移植して腟垢検
査、交配試験を行ったところ、卵巣様組織を移植したヌードラットでは不規則ながらも
性周期が回転し、発情前期に雄ヌードラットと交配させたところ偽妊娠が成立した。し
かし産仔は得られず、卵管内採卵したが卵は採取できなかった。 以上の結果から、異
種での卵巣様構造の作成には、再凝集法で腎皮膜下へ移植する方法が適していると考え
られる。 また、産仔を得るに至らなかったが、これは IVM が確立されていない為、
十分に卵細胞を成熟させられなかったことが原因だと考える。 しかしながら、遺伝子
発現プロファイルが正常卵母細胞と非常に良く似た GV 期卵母細胞が得られており、
IVM の精度を上げることが出来れば産仔を得られる可能性がある。  
 
２、マウス PGC の免疫不全ラットへの移植によるマウス性腺様構造の構築：  
GFP マウス PGC を再凝集法で IL-2RgKO ラットの腎皮膜下に移植し、移植後 28日目に
観察したところ、性腺様組織が認められた。組織標本を作成し検鏡観察したところ、ヘ
マトキシリンエオジン染色標本では、卵胞を伴う卵巣様組織を認め、免疫染色では卵細
胞マーカーである MVH、Stella、陽性の卵胞様構造が認められた。次に、卵巣様組織中
の卵細胞の機能を調べる為に、卵巣様組織から Fine Needle Puncture 法で GV-OLC を採
取し、IVM を行ったところ、GV-OLC のうち 50％が M2 期に成熟した。これらに正常
精子を用いて ICSI を行ったところ 76％が生存し 56％が前核形成と極体放出した
2PN+PB となり、63％が 2細胞期に発生した。さらに、これらを卵管移植したところ 7％
で PGC 由来の産仔を得ることが出来た。これらの産仔には GFP（+）の個体もあり、移
植した PGCを採取した GFP マウス由来であることを確認することが出来た。これらの
雌雄のマウスを野生種の ICR マウスと交配させたところ F1 世代を得ることが出来た。 
以上の結果から、マウス PGC を再凝集法でラットの腎皮膜下へ移植することで、正常
に近い発生過程が進み、機能的な卵細胞が得られることが確認できた。 
4 
 
 
この研究により、雌胎児の前減数分裂始原生殖細胞は性腺間質細胞との共培養、異種
への共移植、試験管内成熟培養を経れば、同種の体内という環境がなくとも正常の減数
分裂を経て機能的卵を産生可能となりえることが分かった。 従って私の研究の目的で
ある生殖細胞再生の小動物モデルを作成し、proof of concept（POC）を示すことができ
た。 
この研究は、大動物やヒトの PGCLC から生殖細胞を得るときに、自家移植を行うこ
となく小型の免疫不全動物を用いて生殖細胞を再生できるという利点があり、将来の生
殖技術や不妊治療の研究にも応用できる画期的な技術であると考えられる。 


免疫不全動物を用いた異種異所発生による始原生殖細胞からの生殖腺様組織誘導

https://repository.dl.itc.u-tokyo.ac.jp/?action=repository_action_common_download&item_id=6971&item_no=1&attribute_id=14&file_no=1

免疫不全動物を用いた異種異所発生による始原生殖細胞からの生殖腺様組織誘導

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

UTokyo Repository