学位の種別:課程博士University of Tokyo(東京大学

horie masafumi

堀江 真史

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[課程―２] 
審査の結果の要旨 
氏名 堀江真史 
 
本研究は下記の 3 つのモデルにおいて三次元培養法を活用し、疾患の病態解明・治療法の検
証をおこなったものであり、下記の結果を得ている。モデル 1：三次元コラーゲン培養法を用いたヒ
スタミンの肺線維芽細胞によるゲル収縮への効果と気流制限における役割解明、モデル2：肺癌細
胞との癌間質線維芽細胞（cancer associated fibroblast：CAF）の三次元共培養による CAFの機能
解析、モデル 3：三次元培養法を活用したTGF-β（transforming growth factor-β）リガンドを標的とす
る肺癌治療効果の検討。 
 
1. モデル 1 において、コラーゲンゲルコントラクションアッセイにてヒスタミンは時間、及び濃度依
存的に HFL-1胎児肺由来肺線維芽細胞を含むコーゲンゲル収縮を誘導することを示した。他
の胎児肺由来肺線維芽細胞株であるWI-38や IMR-90、及び 4例の成人肺由来の初代培養
から得られた正常肺線維芽細胞においてもヒスタミンはコラーゲン収縮を誘導することを示した。
阻害剤を用いた検討で、この効果はヒスタミンの 4 種類ある受容体の中で H1 受容体を介して
いることが明らかとされた。RT-PCRにより、3種類の胎児肺由来の肺線維芽細胞株、及び 4例
の成人肺由来の肺線維芽細胞においてヒスタミン H1 受容体の発現を確認した。ヒスタミン H1
受容体の古典的経路としてdiacylglycerolと inositol 4,5-trisphosphate （IP3）が存在しているが、
これらの阻害剤を用いた検討では IP3経路を介していることを示した。さらに細胞内カルシウム
濃度の測定により、気道平滑筋細胞でよく知られている細胞の収縮のメカニズムと同様に線維
芽細胞でも細胞内カルシウムシグナリングがコラーゲンゲル収縮に関与していることが示唆さ
れた。以上よりヒスタミンは肺線維芽細胞に作用することにより気流制限に関与することが示唆
された。また気流制限が起きている難治性気管支喘息のマネージメントにおける抗 H1 受容体
拮抗薬の可能性を示すことができた。 
 
2. モデル2ではまず癌間質線維芽細胞、及び正常肺由来線維芽細胞（normal fibroblast：NF）の
初代培養の樹立に成功した。引き続いてCAFとNFの比較を行い、定量RT-PCR、及びウエス
タンブロットにて CAFはより α-SMA（α-smooth muscle actin）を高発現しており筋線維芽細胞の
フェノタイプを有していることを示した。またコラーゲンゲル収縮能をCAFがNFと比較して増強
していることを示した。新たに肺癌細胞と CAFの三次元共培養法を樹立し、CAFは 3例のうち
2 例で A549 肺癌細胞のコラーゲンゲルへの浸潤を増強していることを示した。以上より、今回
樹立した三次元共培養モデルは in vivo の癌組織を再現し、癌細胞の浸潤を評価することが
できた。そしてこのモデルで使って CAFの肺癌における役割を解析することができた。 
 
3. モデル 3 では合成 miRNA（micro RNA）発現レンチウイルスベクターの構築に成功した。フロ
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ーサイトメトリーによる EmGFP（emerald green fluorescent protein）の検出を行ったところこれら
のレンチウイルスベクターのA549 とHFL-1への導入効率は極めて良好であった。また ELISA
を用いた上清中の濃度測定では 30％以下の TGF-β リガンドのノックダウン効率を認め両細胞
で効率的・選択的にノックダウンすることに成功した。細胞増殖アッセイでは TGF-β リガンドのノ
ッ ク ダ ウ ン は 両 細 胞 の 増 殖 抑 制 を し た 。 さ ら に A549 で は EMT
（epithelial-mesenchymal transition）マーカーや線維化関連の成長因子が修飾されて、HFL-1
では I型コラーゲンの発現が減少した。これらの細胞の機能に関してTGF-βリガンドのサイレン
シングはHFL-1によるコラーゲンゲル収縮を抑制した。さらに A549 と HFL-1の三次元共培養
モデルにおいて、A549での TGF-β リガンドのサイレンシングは肺癌細胞の浸潤を抑制に成功
した。さらにヌードマウスへの肺癌異種移植モデルではTGF-β リガンドのノックダウンは肺癌の
成長を抑制する傾向を認めた。これらの所見は TGF-β の腫瘍促進能と、TGF-β のノックダウン
による腫瘍間質相互作用の阻害する利点を示唆した。以上より、レンチウイルスベクターを用
いて合成 miRNA の発現系を構築し、肺癌細胞および肺線芽細胞において TGF-β リガンドを
効率的・選択的にノックダウンすることに成功した。この実験系を用いてTGF-β抑制による細胞
応答の変化を調べ、さらに三次元での共培養系を活用して、肺癌治療において TGF-βシグナ
ルを阻害する戦略の有効性を示すことができた。 
 
以上、本論文は三次元培養法を用いて気管支喘息や肺癌など代表的な呼吸器疾患において上
皮-間葉の相互作用が重要な役割を果たしていることを示したものである。今後の呼吸器疾患にお
ける病態解明、治療の有効性の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと
考えられる。 


三次元共培養法を活用した肺上皮間葉相互作用の解明

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三次元共培養法を活用した肺上皮間葉相互作用の解明

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