取得学位：博士(薬学)，学位授与番号：博甲第811号，学位授与年月日：平成18年3月22日,学位授与年：200

Fujimori, Sayumi

藤森 さゆ美

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ダダ藤森さゆ美博士（薬学）博甲第８１１号平成１８年３月２２日課程博士（学位規則第４条第１項）骨関節系細胞に発現するγ－アミノ酪酸シグナリング機構解明に関する分子薬理学的研究米田幸雄（自然科学研究科・教授）宮本謙一（医学部附属病院・教授），山田清文（自然科学研究科・教授），田熊一敞（自然科学研究科・助教授），松下良（自然科学研究科・助教授）氏名学位の種類学位記番号学位授与の日付学位授与の要件学位授与の題目論文審査委員(主査）論文審査委員(副査）ＳＵＭＭＡＲＹIntllecentralnervoussystem（CNS)，glutamate（Glu）andY-aminobutyricacid（GABA）areinajorexcitatoryandinhibitoryneurotransmitters,reSpectivelyPreviousfinClingsthatcentralG1usignalingmacllineriesmediateintercenularcommumcationinbone,ledustoexamnethepossibleexpressionofGABAsignalingsysteminbonecells、Inthepresentstudy;wehaveinvestigatedthepossiblefimctionalexpreBsionofGABAreceptorS（GABAR）anClGABAtransporters（GAT)requireClfbrtransmissionatcentralGABAergicsj7napsesincultureCIratcalvarialosteoblasts、IWPCRanalysisrevealedconstitutiveexpressionofmetabotropicGABABreceptor（GABABR)１sUbumtsinadClitiontotheparticularGATsubtypesBGT1，inosteoblastsculturedfbr4to2Sdaysinvitro・TheGABABRagomstbaclofminhibitedthefbrmationofcAMPbyfbrskolininamannersensitivetotheantagomst2-hydrocxysaclOfen,Whilesustainedexposuretobaclofｂｎｆｂｒ３ｔｏ２８ＤⅣｒｅsultedmsignificantreductionoftheactivitiesofalkalinepllosphataseandofCa2＋accumulationinadditiontothesuppressionofthemRNAexpressionofbonemarkerssuchasRunx2anClosteopontinmculturedratosteoblasts・TlleseresultssuggestthatGABAmayplayahithertoumdentifieClrole、mechanismsassociatedwitllcenularprolifbration，differentiationanCl/ordevelopmenttllroughcentralGABAsignalingmacllineriesexpressedinculturedratcalvarialosteoblasts．-360-、骨格系は、軟骨内骨化による骨新生後も、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成を絶えず繰り返して、再構築（リモデリング）を営むことにより骨の形態と機能を維持している。骨格系の質と量は、骨吸収と骨形成の間に平衡関係が保たれることにより維持されるが、これらのバランスが破綻すると、骨粗議症をはじめとする様々な骨代謝性疾患が発症する。これら骨代謝性疾患に対する診断および有効な治療法の開発には、骨形成を担う骨芽細胞と骨吸収を担う破骨細胞の成熟と機能の調節機構、および両者の相互連関に基づくリモデリング制御機構の解明が必要である。近年、脳内興奮`性伝達物質として働くグルタミン酸(G1u)のシグナル伝達機構に関する研究が進み、破骨細胞および骨芽細胞の両細胞にＧ１ｕレセ,プターおよび同トランスポーターの機能的発現が確認されて、Ｇ１ｕが両細胞の分化・増殖ｐ成熟プロセスにおいて、重要な生理学的あるいは病態生理学的役割を果たす可能性が示されている。一方、脳内神経細胞間ネットワークにおける情報シグナリングには、興奮'性のＧ１ｕと抑制性のγ‐アミノ酪酸（GABA）のバランス維持が深く関与するので、骨組織においてもG1ｕシグナル伝達機構と、ＧＡＢＡシグナル伝達機構が随伴して存在する可能`性が考えられる。したがって、本研究では骨芽細胞における機能的ＧＡＢＡシグナリング機構発現の可能性探索とともに、軟骨細胞や破骨細胞におけるＧＡＢＡシグナリング機構発現の可能`性を追究し、各細胞における同シグナリング機構の病態生理学的および治療学的意義の解明を目指す先駆的研究に着手することとした。我々は以前に、ラット新生仔頭蓋冠由来初代骨芽細胞において、中枢神経系に存在するＧＡＢＡシグナル伝達分子の発現解析を行った。その結果、ラット初代培養骨芽細胞には、ＧＡＢＡ入力系のＧＡＢＡ受容体のうち、メタボトロピック型GABABレセプター(GABABR)を構成する、GABABR1aおよび1ｂの両サブユニット発現が、ｍＲＮＡおよび蛋白質レベルで確認された。一方で、これまでのところ、脳内での機能的GABAB受容体の形成には、GABABR1サブユニットとともにGABABR2サブユニットの発現が不可欠だと考えられているが(JonesetaL,１９９８;Kaupmanneta1.,1998)、初代培養骨芽細胞にはGABABR2受容体のｍＲＮＡの発現は認められなかった。しかしながら、骨芽細胞内のｃＡＭＰ濃度測定の結果、GABABRアゴニストである(ID-baclofmは、fbrskolin刺激で誘導される細胞内ｃＡＭＰ生成を有意に抑制し、この抑制効果はアンタゴニストである2-1]ydroxysaclofenの同時添加により阻害された(FUjimorieta1.,2001)。したがって、骨芽細胞にはGABABR2の発現は認められないものの、ｃＡＭＰ応答性反応を示す機能的なGABABRが存在する可能性が示唆された。今回は骨芽細胞に発現するGABABRを介するシグナル伝達機構についてさらに詳細な解析を試みるとともに、他のＧＡＢＡシグナル伝達分子についても解析を行った。-361-GABABRアゴニスト存在下または非存在下で､３日間から２８日間培養した骨芽細胞について、骨形成マーカーであるアルカリフォスファターゼ（ALP）活性の測定､および骨芽細胞成熟化マーカーとしてＣａ蓄積量の測定を行い、骨形成に対するGABABR刺激の効果を検討した。また、骨芽細胞の分化において重要な役割を果たすことが知られる転写因子Runx2やOsterixおよびATF4、また、骨基質であるオステオポンチンやオステオカルシン等の骨形成マーカーについても､それぞれのｍＲＮＡ発現をノーザンブロッテイング法により確認した。その結果、培養７日から２１日目までの骨芽細胞では、骨芽細胞の分化・成熟とともに増加するＡＬＰ活性が、baclofmの濃度依存的に著しく抑制された(Fig.1A)。また、同条件下で測定した骨芽細胞について、細胞内のＣａ蓄積量を測定したところ、通常は培養１４日目以降から２８日目にかけて急激に増加する細胞内Ｃａ蓄積量は、１００ＩＬＭから１，Ｍのbaclofm濃度に依存して有意に抑制された(FiglB)。また、ノーザンブロッティング解析の結果、baclofmの持続添加により、培養１４日目および２８日目において骨芽細胞分化に必須の因子として知られるRunx2や、骨基蛋白であるosteopontinのｍＲＮＡ発現の低下が認められた。一方で、近年骨基質産生において重要な役割を示すことが示されたＡＴＦ４のｍＲＮＡ発現はbaclofen添加群の骨芽細胞において増加した。Ａ:AIkalinephosphataseactivity１７５０………………－…'…………鰄－………~……………－－…………….藝……￣……………；□ControI1500l-圏Baclo伽(1001Ｍ古150｡-圏Baclo伽(１鬘伽口豐ＭＩｉ三1000ｍ=６.＝ニア５０１－三s｡｡■＿～う『量'１二噸臘３７圏Ba 佗、 10 1Ｍ）圏〃（5001Ｍ）圏〃（１，M）1１ 1４１８２１２８（days）-362-Ｂ:CalciumaccumuIation１２０……－－－…－…､－－－…－…麺………………………………………－………－ｊ□ＣｏｎｔｍＩ ｄ園BacIoね､(1001Ｍ）|翻〃（500,Ｍ）關〃（１，M）100〈一一①亀巨ロュ｝巴巨の芒。◎禺呵。．Ⅱ8０､=６6０ |imm，4０ 腱２０i;-0-｣11腸ＭＭＪｉ墓i曇一３７１１１４1４１８２１２８（days）、9.1．皿髄ｃｔＢｏｆＢａｄｏｈｅｎｏｎｂｏｎｅｆＤｒｍａｔｉｏｎｉｎｃulturedratosteoblasts・Osteoblastswereculturedinq-MEMmeitherthepresenceorabsenceof(R)-baclofbnataconcentrationrangeoflOOIMtolmMfbrdiffbrentperiods辻om3to28DIYfbllowedbydeterminationoftheactivityofALP(A)andCaaccumulation(B).VbLluesaretllemean±Ｓ､Ｅ・丘omsixCliffbrentexperiments.＊Ｐ<0.05,＊*Ｐ<0.01,significantlydiffbrentfiPomeachcontrolvalueobtamedmtheabsenceofbaclofbn．また、GABABR1サブユニット安定発現細胞株を樹立し、骨芽細胞分化および成熟化に対する影響を検討した。その結果、GABABR1安定発現細胞においては、培養日数の経過とともに、対照群と比べてＡＬＰ活性およびＣａ蓄積量の有意な低下が認められた。一方で、GABABR1安定発現株細胞の増殖能においては、対照群と比べて有意な変化は認められなかった。また、GABABR1安定発現細胞における各種骨形成マーカーの発現についてノーザンブロッテイング法により解析した結果、培養１４日目から２８日目にかけて、GABABR1安定発現細胞においてtypelcollagen､osteopontmおよびosteocalcinのｍＲＮＡ発現が有意に抑制された。また、osterixおよびＡＴＦ４のｍＲＮＡ発現は培養７日目から２８日目の培養期間を対照群におけるｍＲＮＡ発現に比べて著しく抑制された。一方でＲｍⅨ２発現は、培養２１日目以降のGABABR1安定発現細胞株でｍＲＮＡ発現の低下が認められた。GABABRに関するこれまでの結果より、骨芽細胞においてはGABABR1サブユニットの発現が認められ、GABABRアゴニスト添加によって骨基質産生が抑制されること、また、GABABR1サブユニット-363-の発現は、骨芽細胞に発現する転写因子の発現を介して骨形成を抑制する事実が明らかとなった。次にラット新生児由来初代骨芽細胞を用いたトランスポーター解析では、[3H]GABAを用いた取り込み活性測定を行うとともに、各種阻害剤を用いて[3H]GABA取り込みの薬理学的性質について検討した。ラット由来初代骨芽細胞においては､ＧＡＢＡトランスポーターについて､ＧＡⅢL1,ＧAＴ２およびＧＡＰ３いずれのサブタイプｍＲＮＡ発現も認められなかったのに対して、BGT１サブタイプのｍＲＮＡ発現がみとめられた。また、ＢｑｌＬ１のｍＲＮＡ発現は骨芽細胞の培養日数に従って増加することが明らかとなった｡培養７日目の骨芽細胞では、Na+およびＣｌイオン依存性の温度依存性[3HlGABA取り込みが観察された。この[3H]ＧＡＢＡ取り込み活性は､Hanes-Woolfplot解析の結果､Ｋｍ値が７８９６士9.011Ｍ、またＶｍａｘ値が４．４士０．１mol/ｍin/mgproteinとそれぞれ算出された。また、ＧＡＢＡトランスポーター各種阻害剤を用いた薬理学的解析の結果、骨芽細胞における[3H］ＧＡＢＡ取り込みは、taurine（IC5o＝４４６士９．０１Ｍ、l3-alamne(IC5o＝４５．７士７．５ILM）で強い阻害効果が認められ、また、mpecoticacid(IC5o＝1.7士０．４，Ｍ)andL-DABA(IC5o＝４１士Ｏ７ｍＭ)によっても阻害された。しかしながら、L-promneおよびbetaineは、何れも[3H]GABA取り込み活`性に著名な影響を与えなかった。ラット初代培養骨芽細胞においては、ＧＡＢＡを基質として取り込むtaurineトランスポーター(I1au1DのｍＲＮＡ発現が認められたが、骨芽細胞におけるＥｌｕＴのｍＲＮＡ発現は骨芽細胞の培養日数によって変化しなかった。また、ラット初代培養骨芽細胞を高浸透圧条件下で培養すると、培養２８日目の細胞において、著しい[3ＨｌＧＡＢＡ取り込み活性の増加が観察された。このとき、ＢＧＴ１ｍＲＮＡ発現は有意に増加したが､ＢＬｕＴｍＲＮＡ発現には変化が認められなかった｡以上のことより、骨芽細胞に発現するＢＧＴ１は浸透圧応答`性のトランスポーターであり、骨芽細胞の浸透圧調節に特定の役割を果たす可能性が考えられた。糖尿病`性骨粗議症のinvitroモデルとして、高グルコース条件下で骨芽細胞を培養する細胞系が考えられている。この様な細胞を用いて、［3H]ＧＡＢＡ取り込み活性を測定した結果、高グルコース条件下で７日間培養した骨芽細胞においては、［3ＨｌＧＡＢＡ取り込み活`性に有意な差は認められなかったが、１４日間高濃度のグルコースを添加して培養した骨芽細胞については、対照群および浸透圧対照群に比して、［3H]ＧＡＢＡ取り込み活`性の有意な増加が認められた。同様の条件下で培養した骨芽細胞を用いて、［3H]G1utamate(G1u)活性の測定を行った結果、［3H]GABA取り込みとは異なり、［3Ｈ]Ｇ１ｕ取り込み活性は培養７日目および１４口目の何れの骨芽細胞においても、高グルコースによる変化を示さなかった。また、高グルコース条件下で培養した骨芽細胞における[3Ｈ]ＧＡＢＡ取●-364-り込み活性のＫｍ値にほとんど変化は認められなかったが、Ｖｍａｘ値の有意な増加がみとめられた｡ＢｄｌＬ１ｍＲＮＡについて半定量ＲＴＰＣＲにより検討した結果、培養１４日目のＢＧＴｍｍＲＮＡ発現はグルコース添加では有意な変化がみとめられなかった。この様に初代骨芽細胞に存在するＧＡＢＡ取り込みは,グルコース存在下で選択的に冗進し、糖尿病`性骨粗霜症の病態に深く関与する可能性が考えられる。以上の結果より、培養骨芽細胞に発現するＧＡＢＡシグナル分子、GABABR1およびＢＧＴ１が骨芽細胞における基質産生の調節を介して骨芽細胞機能に特定の役割を果たす可能性が考えられる。引用文献ＬJones,ＫＡ.,BorowskyiB.,Ｅｌｍｍ,』.Ａ､,Craig,ｎＡ.,Durkin,Ｍ､Ｍ”Dai,Ｍ､,Yao,ＷＪ.,Johnson,Ｍ､,Gunwaldsen,０，Huang,ＬＸ,Iblng,０，Shen,Ｑ,Salon,』.Ａ､,Morse，Ｋ､,Laz,'、,Smitl1,Ｋ.回.,Nagarthnam,，.,Noble,Ｓ､Ａ､,Branchek,ｎＡ.,Gerald,０．（1998）GABABreceptorsfilnctionasaheteromerlcassemblyｏｆｔｈｅｓｕｂｕｎｉｔｓＧＡＢＡＢＲ１ａｎＣｌＧＡＢＡＢＲ2.ハノZYtmle396,674-679.2．KaUpmann,Ｋ､,Malitschek,Ｂ､,SchulenV,Heid,』.,Froest１，Ｗ,Beck,Ｅ,Mosbacher；』.,Bischoff;８，Kulik,Ａ､,Shigemoto,Ｒ､,Karschin,Ａ､,Bettler〉Ｂ・（1998）GABABreceptorsubtypesassembleintofimctionalheteromerlccomple主es、Ｊ１厄2tuz9e396，683-687.3．Ｆ１】jimori,Ｓ､,Hinoi,Ⅱ.,andYUkioY(2002)FunctionalGABA-Breceptorsexpressedinculturedcalvarialosteoblasts・Bibchem・BZqmy＆況色ａＣｂｍｍ肌293,1445-1452-365-学位論文審査結果の要旨本研究では、脳内神経伝達物質であるγ－アミノ酪酸（GABA）シグナル伝達関連分子の骨関節系細胞における機能的発現の可能性を検討した。ラット初代培養骨芽細胞には、メタポトロピック型のGABABレセプター（GABABR）を構成するGABABR１ａおよび１ｂの両サブュニット発現が、ｍＲＮＡおよび蛋白質レベルで確認されたが、GABABR2サブユニットｍＲＮＡの発現は認められなかった。しかしながら、細胞内ｃＡＭＰ濃度測定の結果、GABABRアゴニストのbaclofenは、fbrskolin刺激誘導性ｃＡＭＰ生成を有意に抑制し、この抑制効果はアンタゴニストのa-hydroXysaclofen同時添加により阻害された。GABABRアゴニスト存在下で長期間培養した骨芽細胞では、骨形成マーカーであるアルカリフオスファターゼ活性、および骨芽細胞成熟化マーカーのＣａ蓄積量が、baclofen濃度依存的にともに著しく抑制された。また、ノーザンブロッティング解析の結果、baclofenの持続添加により、細胞分化の必須因子であるＲｕｎｘ２や、骨基質蛋白であるosteopontinのｍＲＮＡ発現の低下が認められた。次いで、ＧＡＢＡトランスポーターの解析を行ったところ、骨芽細胞には４種類のGABAトランスポーターのうち、ＢＧＴ１サブタイプの発現が認められるとともに、Ｎａ+およびＣｌ~イオン依存性および温度依存性を示す［3H］ＧＡＢＡ取り込み活性が検出された。糖尿病性骨減少症のinvitroモデルとして、高グルコース条件下で骨芽細胞を培養したところ、［3H］ＧＡＢＡ取り込み活性の有意な増加が認められた。したがって、培養骨芽細胞に発現するＧＡＢＡシグナル伝達関連分子が、骨芽細胞機能に特定の役割を果たす可能性が考えられる。以上の研究成績は、骨芽細胞におけるＧＡＢＡシグナル伝達系発現に関する世界初の発見であるとともに、各種骨関節系疾患の発症機序解明を通じて、その予防あるいは治療創薬戦略の展開が期待される点で高く評価されるので、論文審査委員会は本論文が博士（薬学）に値すると判断する。-366-

骨関節系細胞に発現するγ-アミノ酪酸シグナリング機構解明に関する分子薬理学的研究

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骨関節系細胞に発現するγ-アミノ酪酸シグナリング機構解明に関する分子薬理学的研究

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