取得学位：博士(工学)，学位授与番号：博甲第873号，学位授与年月日：平成19年3月22

Kurose, Shinji

黒瀬 伸治

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氏名学位の種類学位記番号学位授与の日付学位授与の要件学位授与の題目論文審査委員(主査）論文審査委員(副主査）黒瀬伸治博士(理学）（博甲第８７３号平成１９年３月２２日課程博士（学位規則第４条第１項）マルチメタルセンターを有する酸化還元酵素の機能研究櫻井武（自然科学研究科・教授）片岡邦重(自然科学研究科･助鍛),池田修(自然科学研究科･雛)，鈴木正樹（自然科学研究科･謝受),字梶裕(自然科学研究科･教授）Multimetalloprotemssuchasmulticopperoxidaseandnitricoxidereductasecontainnmltiplelnetalcenterstoexerttheirenzymeactivities、Inll1eseenzymes,electronssuppliedfiomsubstrateorelectroncarieraresuppliedviatlleelectroMMiatorcentertothecatalyticcentersconlprisedofmorethantwometalcenterssuchaslhetrimclearCucenterinnmlticopperoxiClaseandtllehemeD3-nonhenleFecenterinnitricoxidereductase・ThepresentstudyainledateluciClatingtllemechanismshowdioxygenｉｓｒｃｄｕｃｅｄｔｏｔｗｏｗａｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅｓｂｙｌｌ１ｅｔｒｉｎｕｃｌｅａｒＣｕｃｅｎｔｅｒｓｉｎｍulticopperoxidasesandhownitricoxideisreducedtonitrDusoxidebythehemeb3-nonhemeinnitricoxidereductaseBymutatingatAspll2adjacenttoUletrinuclearCucenterinCueO,cuprousoxidasefiomEsc〃〃ｊｃⅦlmcoJi,werevealedtllattllisan血oacidfimctionsastlleprotondonortodioxygenduringtllefbur七electronreductionproceSsofdioxygen・BygivingaperturbationonnitricoxidereduclasefiomHbzJD伽川Ｍｂ化"ｊか抗c伽ｗｅ1℃vealedtllattllebinuclearFecenterisbridgedandantifelromagneticallyinteractedattllerestingstate・AstllenextstageofthestudybwepreparedthefburmutantsofCueO,fromwhichlheregioncoveringmlesubstrate-bindingsitewaspartlyorfiJ11yremoved,exllibitingthatthetruncatedregionfimctionedtoProducetllelnqUesubstrateSpecificityascuprousoxidase・FinallybweperfbnnedtheapplicationstudiestoestablishalargeheterologouseXpressionsystemofanovellaccasefiomFYZz加川肋aMOJZip則andtoconstructabiofhelcellusingCueOascathodicenzyme．-201-へマルチメタルプロテインは分子内に２つ以上の金属イオンを有するタンパク質であり，エネルギー獲得や様々の代謝過程に関わっている．金属イオンとしては銅イオンを有するマルチ銅オキシダーゼや鉄イオンを有する一酸化窒素還元酵素などがあり，多種多様なマルチメタルプロテインが存在している．マルチメタルプロテインの金属中心は多くの場合，電子伝達を担う部位と反応を行う担う活性中心から構成されており，いずれの金属中心も酵素作用の発現に必要欠くべからざる補因子である（Fig.1)・マルチ銅オキシダーゼは分子内に分光学的,磁気学的に性質の異なる3種の銅(TypeI銅，ＴｙｐｅⅡ銅およびTypeⅢ銅)を有している．Typel銅は電子伝達中心であり，有機化合物や金属イオンから電子SOx⑭’底6,831Ｗツ SredFig.１マルチメタルプロテインの慨|略 を引き抜き，ＴｙｐｅⅡ銅とTypeⅢ銅から構成される活性部位である三核銅中心に分子内長距離移動を行う．三核銅中心では最終的な電子アクセプターである酸素分子の４電子還元が行われる．マルチ銅オキシダーゼとしては，ラッカーゼ，アスコルピン酸オキシダーゼ，ピリルピンオキシダーゼ,ＣｕｅＯなどがあり，微生物から哺乳類にまで広く存在している．マルチ銅オキシダーゼは基質特異性が幅広く，様々な分野での工業的利用価値が高い．マルチ銅オキシダーゼはその反応に際して活性酸素を系外に放出しないこともまた,マルチ銅オキシダーゼの潜在的用途が広い理由である．しかし，熱やpHに対する安定`性，示適pH領域などに制限があり，その利用は極めて限定的なレベルにとどまっている．そこで構造，機能に関する基礎的研究のみならず応用をも視野にいれて本研究を行った.さらに，マルチ銅オキシダーゼと機能の点で共通性の高い末端酸化酵素の先祖酵素と考えられる一酸化窒素還元酵素において，活性部位である高スピンヘムb3と非ヘム鉄FeBからなる複核部位に摂動を与えることによって，構造および反応機構に関する知見を得た．【FMammuIinavelUliPes由来ラッカーゼの異種発現系構築と組換え体のキャラクタリゼーシヨン】バイオリソースとして有用なラッカーゼを探索し，最もポピュラーな食用キノコのひとつであるFｿammulmavemliIDes（エノキタケ）由来のラッカーゼFlaclをスクリーニングによって見出した．このラッカーゼは中性領域に示適ＰＨを有する新規のラッカーゼであることが選定のポイントとなった．しかしながら,原vemliIDesの培養には２ケ月を要し,その収量もまた低いものであった(約１０８unit/L)．また，この酵素の精製は容易でなく，野生型Flaclの精製は部分精製にとどまった．そこで，Flaclの工業的利用を視野に入れ，異種大量発現系の構築を試みることにした．研究の順序としてはまず，ＦＩａｃｌ遺伝子の塩基配列を決定し，次いで酵母を宿主とする異種発現系を構築し，発現した組換え型酵素の特性を評価した．FIac1のＮ末端アミノ酸配列および白色腐朽菌ラッカーゼで高く保存されている銅結合部位周辺の配列をもとにして作製したプライマー，またはオリゴ。Ｔプライマーを用い，ＥｖｅｌｕｌｉＰｅｓから抽出したｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により，成熟Flac1をコードするcDNA(M91bp)を得た．このcDNAを酵母発現用プラスミドに組み込み，酵母のMactor分泌シグナルを用いてFlaclの菌体外発現を試みたが，組換え体は菌体内にしか発現をしなかった．そこで，酵母を宿主として分泌発現の実績を持つPICwoIUssa/◎'ちCa/Ｕ由来のラッカーゼのシグナルを使用することにより，酵素の菌体外分泌に成功した．－２０２－分泌酵素を含む培養上漬から各種クロマトグラフィーによって組換え型FIacl(rF1acl)の精製を行った．収量は野生型酵素と同程度であったが，培養に要する時間は約１/１０に短縮された．得られたrF1aclの吸収，ＣＤ，およびＥＳＲスペクトルを測定したところ，マルチ銅オキシダーゼに特徴的なＴｙｐｅｌ銅，TypeⅡ銅，およびＴｙｐｅⅢ銅を確認することができた．また組換え型酵素は野生型酵素と同様に中性領域に至適ｐＨを示した．しかしながら，この組換え体の安定性はあまり良好ではなかったことから，発現系のさらなる改良には着手せず，研究対象をＣｕｅＯに移した．【CueOの基質特異性とプロテインエンジニアリング】ＣｕｅＯは大腸菌のペリプラズムに存在する分子量534kDaのマルチ銅オキシダーゼであり，銅のホメオスタシスを維持する役割を担っている.他のマルチ銅オキシダーゼと同様に,分子内にTypel銅１個，TypeⅡ銅１個,TypeⅢ銅２個をＭ４４１－弓r勾函陸－．有しているが，これら４個の銅結合部位以外に，結合力の弱い５番目の銅結合部位を，タイプＩ銅部位を覆うメチオニンに富む部位に持つことが明らかにな●っている(Fig2).CueOはCu（１）に対する酸化活性が著しく高い１１２カヨ，他のマルチ銅オキシダーゼと比較して有機基質に対する酵鑪二１k‘瞳竃笙ロー巴 i二L’、魁騨恐Ｆｉｇ２ＣｕｅＯの活性部位近傍の結晶構造（Roberteta1.2004） ～しｕやエレＬ←曰1滋奎｣実収￣ＸＵ，。白子素活性は極めて低いか，また}ま有していない．しかしながら，大過剰のCu(Ⅱ)の存在下では，p-phenyIenediamineやABTS酸化活性は10~30倍以上に増大する．これは，基質結合部位に存在するＣｕ(Ⅱ)が有機基質とTypeＩ銅間の電子移動メデイエーターとしての機能を示すからであると考えられている最近,われわれの研究グループでは，基質結合部位を覆うＣｕｅＯの５～7番目の３つのαヘリックスと６番目と７番目のヘリックスの間に存在する２５残基のアミノ酸を除去した変異体CueO(△oL5-7)を作製した．この大きくプロテインエンジニアリングした改変体にはCu2+を添加しなくとも，ＣｕｅＯと比較して有機基質に対する高い反応活性が創製されることを明らかにした．そこで，本研究では，この除去したかさ高い領域が金属オキシダーゼとしての基質特異性を産み出す分子構造であることを証明することを目的とし，野生型ＣｕｅＯとCueO(△α5-7)の中間的な構造を持つ変異体を３種作製した．作製した変異体の吸収，ＣＤおよびＥＳＲスペクトルのから，３種全ての変異体においても活性部位付近に大きな構造変化は起こっていないことが明らかになった．また，活性測定の結果，５－７番目のへワックスによってTypel銅付近への有機基質のアクセスを制限することにより,ＣＵ(1)に対する特異性が生み出されていることを証明することできた．これに付随して，最もサイズの大きな５番目のヘリックスによる立体障害が最も大きいことも明らかになった．【CueOによる酸素還元反応における非配位性Ａｓｐの役割】マルチ銅オキシダーゼ特有の機能のひとつは酸素の４電子還元である．この酸素４電子還元反応において，プロトンの供給は円滑なターンオーバーにとって必須である．ＣｕｅＯの反応過程におけるプロト－２０３－ンドナーとなりうるアミノ酸の候補としてAspll2に着目した．Aspll2はTypeⅡ銅の背後に存在し，TypeⅡ銅の配位水や配位子としてのＨｉｓイミダゾール基と水素結合している(Fig.2)．この酸性アミノ酸は他のマルチ銅オキシダーゼでも高く保存されている．そこで，このAspll2を同じく側鎖にカルボキシ基を有するGIu，Ａｓｐの側鎖がアミド化したAsn，さらにＡｌａに変異させ，酵素活性や各種スペクトルにどのような影響が現れるか検討した．Aspll2GIuでは酵素活`性は約半分に低下し，一方，カルボキシを持たないＡｌａ,Asnへの変異では野生型ＣｕｅＯの１０％にまで活性が減少した.これらの結果から，112位のＡＳＰのカルボキシ基の存在が酸素活性の発現に必須であることがわかった．一方，Aspll2への変異によって三核銅部位に関連したスペクトルもまた変化したことから，このアミノ酸は三核銅部位の構造と性質にも関係することが明らかになった．【CueOのバイオ燃料電池のカソードとしての利用】燃料電池の中で生体触媒，つまり酵素や微生物自身を触媒として用いるものはバイオ電池と呼ばれている．バイオ電池は水素，糖やエタノールなど，金属触媒では一般に困難とされる様々な化合物を燃料として利用できるといった特徴を有している．バイオ電池においては，負極側の酵素（グルコースデヒドロゲナーゼなど）によって糖やアルコールなどから取り出された電子は，正極側の酵素によって，酸素を水へと還元するのに使用される(Fig.3)．正極側の酵素としてathode1まピリルピンオキシダーゼなどマルチ銅オキシダーゼが使用されるのが一般的である．アスコルピン酸オキシダ０ －ゼ，ビリノレピンオキs/ダーゼ，ラッカーゼなど多くの酵素で，酵素と電極間での直接電子移動が確認されているが、本研究ではＣｕｅＯがBioeIectmcataIysisとして機能するかどうか検討した．灰ｌ サイクリックボノレタンメトリーによってＣｕｅＯの電気ＢｉｏａｎＦｕｅｌ汁に’Fig.３バイオ燃料電池の概略図サイクリツクホルグンメトソーIL-＋っししｕｅｕｖﾉ電丸化学特性を評価した結果，他のマルチ銅オキシダーゼと同様に直接電子移動を行うことが確認された.大過剰のＣｕ(Ⅱ)存在下でもサイクリックボルタモグラムに大きな違いはなかった．このため，電子は電極からTypel銅へ直接移動していると考えられ,Ｃｕ(Ⅱ）存在下での有機基質に対する反応とは異なっていることが示唆された６また，回転電極を用いて測定した限界電流から，少なくとも1,500rpmまでは，酸素の供給律速になっていることがわかった．ピリルピンオキシダーゼやラッカーゼを用いた場合と比較すると,電流値はそれぞれ８倍と９倍となっており，CueOの触媒速度定数は他の直接電子移動を行うマルチ銅オキシダーゼと比べて最も高く，ＣｕｅＯはバイオ電池のカソード酵素として最も優れたマルチ銅オキシダーゼであることが判明したことから，今後の発展の先がけとなるデータを得ることができた．-204-【－酸化窒素還元酵素の活性中心と機能】ＮＯＮ2０一酸化窒素還元酵素(Nitricoxidereductase，NOR)は一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する酵素であるＮＯＲは低スピンヘムｃを含むNorCサプユニツトと，低スピンヘムb，高スピンヘム６３および非ヘム鉄を含むNorBサプユニットから構成される．ＮＯをN20に還元する際に必要な電子は可溶性のシトクロムｃのような電子供与体から与えらＮｏｒＣＮｏｒＢれpH低スピンヘムｃ，低スピンヘム６を経由して，高スピンヘムb3と非ヘム鉄FeBからなる複核中心Fig.４ＮＯＲの概略図へと伝えられる．この複核中心はNORの触媒中心と考えられるが，休止体や還元体の吸収，MCD，ESRスペクトルから得られる情報には限りがあった．そこで，高スピンヘムb3と非ヘム鉄FeBが反強磁性相互作用によってマルチ銅オキシダーゼのTypeⅢ銅のようにESR非検出になっているとの仮定のもとに,ｐＨを低下させるとこの部位の構造が摂動を受け複核中心に関する情報が得られるものと期待した，さらに，NORの活性部位の構造に関する詳細な情報を得るために，シアン化物イオンやアジ化物イオンのようなサイズの小さなアニオンをプローブとし，ｐＨ7.0とｐＨ５．０で酸化状態と還元状態のNORに作用させた.これらの実験結果から,高スピンヘムb3と非ヘム鉄FeBには休止状態においてオキソ基が架橋し反強磁性相互作用しているが，低pHでは架橋基へのプロトン化により摂動をうけ，基質であるＮＯが活性部位に結合できることが示された．すなわち，可NORはpHにより異なるメカニズムで反応が進行することが示された．－２０５－学位論文審査結果の要旨本論文は４つの銅センターによって活性中心が構成されているマルチ銅オキシダーゼであるラッカーゼとＣｕｅＯ、ならびに４つの鉄中心によって活性中心が構成されている一酸化窒素還元酵素の機能に関する研究で、基礎から応用にいたる幅広い視点で取り組まれた。ラッカーゼについては実用的な視点から、中性から塩基性で活`性を示す新規ラッカーゼを探索し、そのキャラクタリゼーションを行うとともに、アミノ酸配列を決定．し、構築した酵母を宿主とする異種発現系によって組換えラッカーゼのキャラクタリゼーションまで行った。ＣｕｅＯについては点変異によって酸素の４電子還元に関与するアミノ酸を特定し、また、基質結合部位に対して種々の改変を行い、基質特異性の起源を解明した。さらに、直接電気化学を行い、この酵素が生物燃料電池のカソード酵素として最適であることを見いだした。一酸化窒素還元酵素については活性部位を形成するヘムー非ヘム鉄複核部位の構造と機能を明らかにした｡以上のように黒瀬伸治君は極めて複雑な活性中心を有するマルチメタル酸化還元酵素の機能に関する基礎から応用にいたる幅広い研究を行った。１２月２日の口頭発表と質疑応答による予備審査に始まり、各審査員による個別審査、２月７日の学位論文審査会を行い、博士（理学）に値すると結論した。在学期間は１年であるが、短縮に関わる条件を全て満たしていることを確認した。．。－２０６－

マルチメタルセンターを有する酸化還元酵素の機能研究

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マルチメタルセンターを有する酸化還元酵素の機能研究

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