取得学位：博士(薬学)，学位授与番号：博乙第321号，学位授与年月日：平成20年3月22

Nishio, Tadashi

西尾 忠

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氏名学位の種類学位記番号学位授与の曰付学位授与の要件学位授与の題目西尾忠博士（薬学）博乙３２１号平成２０年３月２２日論文博士（学位規則第４条第２項）ステロイドのトレースキャラクタリゼーションを指向したLC-ESI-MS用誘導体化法の開発(IhfaceCharacterizationofSteroidsOrientedDevelopmentofDerivatizationProcedurefbrLC-ESI-MS）東達也（自然科学研究科・准教授）島田和武（自然科学研究科・教授)，早川和一（自然科学研究科・教授)，中垣良一（自然科学研究科・教授)，藤井洋一（北陸大学・教授）論文審査委員（主査）論文審査委員（副査）SummaryThefOUowingtwosubjectsconcerningsteroidanalysesusingliquidchromatography-electrosprayionization-massspcctrometry(LC-ESI-MS)havcbecndone、ThcfirstoneisthedcvelopmcntoftheESI-activedcrivatization（chargcdderivatization）reagents， （PPz)，１－(2,4-dinitro-5-fluorophenyl)-4-mcthylpiperazincand4-(4-mcthyl-1-pipcrazyl)-3-nitrobenzoylazide（APZ)，fOrhydroxysteroids，PPZselectivelyreactedwithaphenolichydroxygroupinestrogens・AfterquatcrnarizationofPPZ-estrogenswithmethyliodide,theresultmgderivativesprovidedmorethan2000-fO1dhighersensitivitycolnparedtothemtactestrogens，Afterderivatizationofsteroidshavinganalcoholichydroxygroup(5-cncor5-reducedsteroids)withAPZfOmowedbymcthylation,theirdetcctionresponsesincreascdmorethan500times・ThesederivatizationprocedurescoupledwithLC-ESI-MS/MSweresuccessfilllyusedfOrthedctenninationofestrogensintheprcgnantserumandprostatic5q-dihydrotestosterone，rcspcctively、ThesecondoneisalternativeprocedurctocnhancethedctectionrcsponsesofsteroidsthatchargedderivatizationisnotsuitablefOm2-HydrazinopyridincorisonicotmoylazidewasveryeHCtivefOrthesensitivedetectionofdioxosteroidordⅡlydroxysteroid，respectivclylandthedetectionlimitsoftheresultingderivativcswercaslowasZfinoLはじめにステロイドは生命機能維持に必要不可欠な生体分子であり，その消長を的確に把握することは臨床診断や生命科学研究上極めて重要である．ステロイＦの定量法には種々のものが知られているが，プロフィール分析可能なクロマトグラフ法,特にＨPLCはGCでは不可能な抱合体などの高極性化合物を水解することなく直接定量できることからステロイＦ定量法選択のファーストチョイスと考えられる．またＧＯＭＳ,ＬＯＭＳに代表されるハイファネイテッドテクニックは，クロマトグラフ法の高分離能とＭＳの豊富な情報量，高感度`性を併せ有する信頼性に優れる分析法である．ＧＯＭＳがすでに完成されたものであるのに対し,ＬＯＭＳも実用化の段階から完成のそれに入り，特に大気圧化学イオン化法（APCI）やエレクトロスプレーイオン化法（ESI）などの優れたイオン化法の開発は，本法を現在最も信頼できる超高感度分析法にまで成長させたＬＯＭＳの特長は適用範囲の広さと高感度分析が可能な点にあるが，採取量に制限のあるヒト体液（血液，唾液など）及び各種組織などの複雑なマトリックス中に超微量（ng-fg/mL又は､9－３fg/gtissueレベル）で存在するステロイドの分析は容易でない場合も多い．一方化学構造上，APCI,ESIのいずれのイオン化法でも十分な感度の得られないステロイドのあることも知られている．この感度面における問題解決の一つの手段としてAPCI-又はESI-MSに高感度に応答する分子構造を測定対象に導入させる誘導体化法がある．先に著者はAPCIの中でも特に電子捕獲APCIの特長に着目し，有用な誘導体化法を開発し（Ｎｌ－６３１－た．しかし本法は適用可能な機種が限定されるなどの欠点を有していた．そこで現在市販されているLC-MS装置に標準装備されているESI-MSに着目し，普遍性の高いLC-ESI-MS用誘導体化試薬の開発を行い，この問題の克服を目指した．1．LC-positiveESI-MS用chargedderivat並ationの開発ESI-MSはグルクロニド，サルフェートといったイオン性官能基を有するステロイドやプロトンが付加した際，電荷の非局在化による安定化効果を受ける3-オキソー4-エンステロイドに高感度に応答する．これに対しエストロゲン，５－エン及び5位還元型ステロイドはプロトン親和`性が低いため，イオン化効率が悪く実用的な感度が得られない場合がある．この様な背景から著者はフェノール性水酸基（エストロゲン）又はアルコール性水酸基（5-エン及び5位還元型ステロイド）と容易に反応し，それらの高感度検出を可能とするLC-positivcESI-MS用誘導体化試薬の設計及び合成を行った．そして，エストロゲン用試薬として，ＥＳＩに高感度に応答する4級アンモニウム構造へと変換可能なアミノ基と，フェノール性水酸基に対する反応活性基として2,4-ジニトロフルオロベンゼン構造を併せ有する１V，-(5-fluoro-2,4-dinitrophenyl)三ＭVとdimethyl-1,Z-cthanediamme （P、）及び1-(2,4-dinitro-5-fluorophenyl)-4-methylpiperazmc（PPZ）を1,S-dmuoro-2,4-dinitrobcnzeneから，いずれも安定な結晶として得た（Chartｌ)．両試薬はエストロン（E,）及びエストラジオール（E2）と炭酸水素ナトリウム存在下，アセトン中60℃，１ｈ加熱することで選択的かつ定量的に反応し，さらにヨウ化メチルによる分子内アミノ基の4級化（chalgedderivatization）が容易に可能であった．得られた誘導体をLC-ESI-MS（AppliedBiosystemsAPI2000,流速0.2mL/min;以下同じ)に付したところ,これらはいずれも分子ｲｵﾝ[M丁を基準ﾋﾟｰｸｲｵﾝとして与え，フラグメントイオンは殆ど生じなかった．また，より高感度化に優れるPPzを用いて得られた誘導体(E1-MPPzE2-MPPZ）の検出限界を選択イオン検出（SIM,S/N=5）で求めたところ，ステロイド量に換算して共に0.15ｐｇであり，誘導体化前のE,及びE2と比較して，それぞれ2300,4000倍と飛躍的な感度上昇が見られた．次にPPZを用いて胎児胎盤系機能診断上重要な妊婦血清中E,及びE2の同時定量を行った．健常妊婦血清（10又はＺ０ｕＬ）に[2H5l-E,（IS）を添加，除蛋白，固相抽出後，上記誘導体化反応に付した．LOESI-MS/ＭＳ[YMC-PackC8(５ILm,150×Ｚｍｍｉｄ.),McCN-McOH-10mMHCOONH4(4:1:5,v/V/V),選択反応検出（SRM):Ｅ１－ＭＰＰＺｍ/Iz549.3→502.4,Ｅ２－ＭＰＰＺｍ/lZ551.3→504.3及び[2H5]-E1-MPPZ肱554.3→506.4］で分析したところ，検量線は05-25,9/mLの範囲で良好な直線性を示し，同時再現性も良好であった．この場合，ＳＲＭによる選択性の向上と，それに伴うバックグラウンドノイズの低下が高感度分析に有用であった（Fig.１)．これらを踏まえPPZが市販される予定である．a）q:□ﾄﾞﾘﾋﾞｺc〔:q章ばこM鼠Ｃｓ''二’b）ＯＳＤ (nWＥ554.3→506.q）､３→502.4）043）HＯＮＯ２Ｒ=０：Ｅ１ Ｒ=０：ＥｆＭＰＰＺＲ=ＤＯＨ：Ｅ２ Ｒ=DOH：E2-MPPZChartLSynthesesofPEDandＰＰＺ(a)andConversionofEsh⑩genstoTheirMPPZ･derivatives．ＴＩｍｅ(mIn）画9.1.Chmmatogran西ofDeIivati正ｄＥ１,E2andlSfmmSemdfP正gmntWOman(21舵eks).MeasumdconcentmtionsofEImdE2w巴正1.84,9/mLand3.43mg/mLmspectiveIy．仏一方,５－エン及び5位還元型ステロイドのアルコール性水酸基に対する反応活性基として酸アジド基を有する４－(MVnimcthylethylencdiamino)-3-nitrobcnzoylazide（AED）及び4-(4-mcthyl-1-pipcrazyl)-3-nitrobenzoylazide(APZ)を4-fluoro-3-nitrobenzoicacidからそれぞれ４工程を経て合成した（Chart２)．これらはベンゼン中，８０℃で加熱するのみで定量的に水酸－６３２－基と反応し対応する誘導体を与えた．中でもAPZを用いた場合，本誘導体化とヨウイヒメチルによるアミノ基の4級化を施すことで誘導体化前より500倍以上の感度上昇が確認された(SIM)．次にAPZを，前立腺癌との関係が示唆されているｓｄ－ジヒドロテストステロン(DHr）の前立腺組織中濃度測定に適用した．ａ）組織(Ⅲ､農)に｢H，肝DHTqS)を添加前処岬Ｏ:q了…Ｃ〔:.。理後，上記誘導体化反応に付し，LC-ESI-MS/ＭＳ[YMC-PaCkProC18RS(511m，鮴)鮒,;111;z１基1澱3Ｗ;而剛.~c〔:い÷''二ｒＭ壜。÷ＮＪ１－ＡＰｚ及び[zH3]-DHTLMAPZ"z/ＩＺｒ570.2→570.2］で分析したところ，検量線はLO-20ng/gtissueの範囲で良好な直線性を示し，同時再現性も良好であった． 1c1壬Ｈ１;〉 診､１M．=io-DHT-MAPZ2.Chargedderivatization補完法の開発ChaIgedderivatizationを同一官能基(オキ鵬愚慨鯛１K;l:;:U13lililm:,:;HHl鯛鍋iHHl:ｌ１ｉ.；ソ基又は水酸基）を複数有するステロイド（iii)6MHCI;(iv)Diphmylphosphorylazide、に適用した場合，生成する誘導体の気相における安定性の低さから，多数のフラグメントイオンが生じ，飛躍的な感度上昇は期待できない．そこで，これを補完する誘導体化法を開発した．その結果，いずれもピリジル基をESIに応答する原子団として有する他，ヒドラジノ基又は酸アジド基を反応活性基とするZ-hydrazinopyridine（HP）及びisonicotinOylazidc(ⅢA）が各々ジオキソステロイＦ又はジヒドロキシステロイドの分析に有効なことを明らかとした（Fig.２)．これらはいずれも既知物質であるが，得られた誘導体は強度の強いプロトン化分子[Ｍ+H]+を与え，chargedderivatizationを適用した場合と比較して最大200倍，誘導体化前と比較して最大600倍感度が上昇した（SIM)．さらに実試料分析への適用例としてⅢAを用いるラット脳内5ｑ－アンドロスタン-3α,176-ジオール（3α'5a-Adiol）の定量を行い，その有用性を明らかとした．ラット脳抽出液（l00mgtissucに相当）に[2113]-3α,Sq-Adiol(1s）を添加,２段階の固相抽出による精製後,INAで誘導体化し，LC-ESI-MS/ＭＳ[YMC-PackProC18RS,McCN-MeOH-10mMHCOONH4(1:2:1,v/V/v),ＳＲＭ:３α,Sq-Adiol-bislNA雌533.3→139.0及び[2H3]-3α,SoL-Adiol-bismJA肱536.3→139.0］で分析したところ，検量線は0.1-2.0,9/gtissueの範囲で良好な直線性を示し，精度，用量で動物に投与する＆域些c｢乱ぱj;〉正確度共に優れるものであった．３c1,5q-Adiolを高抗不安作用が発現すると鵜灘Ⅱ－砿Hili‐LLcIjddSl上ごｉｒｏ理的意義解明の一助になるものと期待される．3.NegativeESI-MS用誘導体化試薬の検討以上はいずれもpositiveESI-MS用誘導体化試薬であるが，よりノイズレベルが低いと予測されるnegativeESI-MS用のそれについても検討した．これまでにnegativeESI-MS用誘導体化法として，測定対象に硫酸基を導入した報告があるが，本法は得られる誘導体が極めて高極性となるため，生体試料分析の際，逆相HPLCにおける内因性來雑物との分離が問題であった．そこで，適度な脂溶`性を有し，かつnegativcESI-MSに高感度に応答する試薬を探索した．この結果，オキソステロイドと反応した際，生成するヒドラゾンのプロトンが二－633-トロ基の高い電子吸引性でもって脱離されやすいと考えられるニトロフェニルヒドラジン(NPH）及びその関連化合物に着目し，その性能を評価した．この結果，期待通りいずれのNPH誘導体も，ESI-MSにおいてその分子内のヒドラゾンの脱プロトン化により生じた[M-H]を強く与えた．これらの中で,４－NPH誘導体では誘導体化前のステロイＦと比較して1000倍の感度上昇が認められ期待されたが,ＭＳ/ＭＳの際,ＳＲＭに有効なプロダクトイオンが得られず,実試料分析には適用困難であった．しかし，本研究によりNPH誘導体は適度な脂溶性を有するため，逆相カラムにおいて保持され易いこと，ならびに高感度検出に最適なニトロ基の置換位置の予測が可能であることなど今後の試薬開発において有益な知見が得られた．以上のように著者は,ESI-MS用誘導体化による超高感度化とそれに基づく選択性の向上(SRM）により生体内超微量ステロイドの分析を可能とした．開発した方法はステロイドのみならず,他の生理活性物質の分析へも適用可能であり今後が期待される．学位論文審査結果の要旨肉困進丞云只巡堕ｎ分&[､主JH砿診胤－J生:命[饗裳l】f寵上極めＸ』重票nji?.n:…髭Ｑ友迭論・≧と、｣9Ｍ二．丞必肇i王訂丞.窪壬段上な２．，１畳魁…１Ｍ]皇迦、L》量黒l:ご:嚢上且ZHズ止冤弘衣剖匡塗一但SIL蚕にttごf・丈迂化.三ｍ雛11搬造塗宜ｺｩﾆ量悉云只盃_Ｅ迄坐猛.≦.な_い…提塵煮蛙.二n点の哀腿塗貝指上重i霧j蕊j杢jL1塗導入上必ｒＱ史亘な｣jX1暴塗得た1-.－－…………＿エストロゲンを対象としたフェノール性水酸基用試薬として●■￣●●■●￣￣￣￣￣｡■￣Ｃ￣￣ヴー￣●■■●■￣●￣￣･●￣■￣の￣￣￣ロー￣￣￣●￣￣￣￣￣ロー⑤ＣＯ●￣●￣●■●■⑪■⑤Ｃロー●■￣●●■￣●●●●･■■￣■■●■■■￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣･￣●●●●●●￣￣■￣￣の■●の●￣●￣■￣－￣－－－－－－－つ－●■■●■■￣ロ■｡■￣￣■￣■￣￣￣－－－－－－－'三(二.知initlpﾆﾐﾖjquQIpphQnl)４melhYlEipe幽胆lHPZLiItUMZ壬定)一之閑発した_亀_穂iii蕊はＺ黒､fj百三;１１２性水酸基上容＃易…な。i鑿ｊ１５Ｌ堕鷹反iliiiL:,….童ら.1二目立仏Z・王１１ぞ、(紐山(蝿畷ｄ卿Ya4j裏aljQnL種室-1-畳.巨jLL左誘導慾鰯；蝋佳化節Q2QQQ借必上Ｑｊ薑i感度猛応餐i堂丞と左:．また水j駿基鼠Ｉ二煙企el狐｡t虹1二'二pip目ｌｎｊＰyｎ畳迦仙靭星QxL鰹idc塗閉蕊.L灸.髭の有思惟塗襄証上迄鼻一室且1三:.…これらＱ友迭面陸士分重な阯二.乏只fJEjH認i蕊伽上議l震塗閉発上差Ｑ有用性を実証した．以上囚圭_豆』三里誌煮ＱｌＨｆ窓1主２－L空理ＳＩＭＳ・の有田進塗忌段とL量!さ山並員よ.つ.鷹ミニ去壹itL迄ｊＬｌ－Ｑ蚕迄、,…鋼ｌｆ化袰Ｑｉ隻露1三賓畳式量』Ｍ１と墨ねt1f員:…論Ｘｐｊ蜜i査睦副鴦Ｉ皇よゑ臺前n面j妾２－公臘会Lに鐙は量目j蕊i間塗耀X:征ね妊腰上_儀袰川冒担当.丈鼠Ｍ).と劉駈された．の￣ロ￣￣￣の￣￣■●句一■■●ののＤＣ￣のロー￣￣口つ●￣￣□ＣＤ￣①●ロー■の￣の●の￣～￣●●｡‐｡■￣白の￣￣￣￣■、￣の●￣￣●●￣￣￣●■￣｡￣￣Ｏ●｡￣の⑤￣⑤￣の●の●●の￣￣￣￣－￣￣●￣￣￣￣￣●￣￣ｑＣＣｃＣ￣￣￣￣￣￣■■■■－－－－￣⑤￣のロー■⑤￣￣￣－Ｃ－ｃｏ－－－￣－－￣－－－－－－￣■■口一-634-

ステロイドのトレースキャラクタリゼーションを指向したLC-ESI-MS用誘導体化法の開発

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ステロイドのトレースキャラクタリゼーションを指向したLC-ESI-MS用誘導体化法の開発

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