13301甲第4187号博士（創薬科学）金沢大学博士論文本文Full 以下に掲載：The Journal of Japanese Botany 90(3) pp.235-248 2015. 植物研究雑誌編集委員会. 共著者：Hirokazu Ando, Masashi Matsumoto, Maksut Coşkun, Turgut Yilmaz, Nathalie Allain, Yohei Sasaki, Masayuki Mikag

Ando Hirokazu

安藤 広和

13301甲第4187号博士（創薬科学）金沢大学博士論文要旨Abstract 以下に掲載予定：The Journal of Japanese Botany 90(3) pp.235-248 2015. 植物研究雑誌編集委員会. 共著者：Hirokazu Ando, Masashi Matsumoto, Maksut Coşkun, Turgut Yilmaz, Nathalie Allain, Yohei Sasaki, Masayuki Mikag

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氏 名 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号学 位 授 与 の 日 付 学 位 授 与 の 要 件 学 位 授 与 の 題 目 論 文 審 査 委 員 安藤 広和 博士（創薬科学） 　 　      甲第4号平成 27 年 3 月 23 日 課程博士（学位規則第４条第１項） Ephedra equisetina Bunge 及び 近縁植物の種分類と多様性に関する研究 主査 佐々木 陽平 副査 御影 雅幸 副査 後藤(中川) 享子 副査 山下 克美 副査 鳥羽 陽 学位論文要旨  Abstract 	 The classification of Ephedra plants has long been a matter of debate, as Ephedra plants have few morphological characteristics to aid classification. In particular, the distinction between E. equisetina and E. major ssp. procera is uncertain. In general, E. equisetina is a medicinal species prescribed in JP16. However, E. major ssp. procera is not used as medicine in Japan. We intended to study the phylogenic relationship of E. equisetina and E. major ssp. procera by molecular analysis and the content of ephedrine alkaloid. In the molecular analysis, we investigated nuclear internal transcribed spacer (ITS) and chloroplast trnK genes used frequently for phylogenic analysis of closely related taxa of plants. In the analysis focusing on Ephedrine alkaloid content, we quantified ephedrine alkaloids (Ephedrine (E), Pseudoephedrine (PE), Norephedrine (NE), Norpseudoephedrine (NPE) and Methylephedrine (ME)) by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis. Molecular analysis revealed that E. equisetina and E. major ssp. procera have a close relationship with differing matrilineage, and chemical analysis showed that they have the same characteristic which varied alkaloid composition ratio by collection site. In addition, E. equisetina and E. major ssp. procera contained no less than 0.7% of total alkaloids. Thus, we suggest that on the basis of molecular phylogeny that E. major ssp. procera should be treated as a synonym of E. equisetina. We concluded that E. major ssp. procera could be used to produce Ephedrae Herba. 【背景】 	 マオウ科（Ephedraceae）Ephedra 属植物は，ユーラシア大陸，アフリカ大陸北部，アメリカ大陸西部の乾燥地帯に約 50 種類自生する分類群で，中国には Ephedra sinica Stapf，E. intermedia Schrenk et C.A.Meyer, E. equisetina Bunge など 14 種の Ephedra 属植物が自生している．Ephedra 属植物は外部形態的な分類形質が少なく，種分類が困難な一群であるため，種の位置づけが常に議論されている．例えば，中国に自生する E. sinica と ヨーロッパからアジアにかけて広く分布する E. distachya L. は分類学的に意見が分かれていたが，Ni らによる分子生物学的研究により，これらは別種にするべきであると報告された．また，E. sinica と E. dahurica Turcz. との関係は Kakiuchi らによって同じ分類群であることが報告された．一方で，E. equisetina とユーラシア大陸西部に分布する E. major Host subsp. procera (C.A.Mey.) Bornm. においても形態学的特徴が類似しているため，分類群の区別は不確かで混乱している．中国植物誌の E. equisetina の項目には「本种的木质茎较高大，在外形上与树状麻黄 E. procera Fisch. et Mey. 及南欧麻黄 E. nebrodensis Tineo 极为相似，在分类工作中因之也常有合并、分开及误定的情况。」との記載があり，E. major ssp. procera（=E. procera）は E. equisetina のシノニムとして判断される場合がある．すなわち E. equisetina と E. major ssp. procera 両分類群は，それぞれが形態的な多様性を示し，このことが種分類を困難にしている． 	 Ephedra 属植物の中には地上茎が薬用として使用可能なものがある．日本では，第十六改正日本薬局方（JP16）に，Ephedra sinica Stapf, E. intermedia Schrenk et C.A. Meyer, E. equisetina Bunge の 3 種に由来する生薬麻黄が収載されている．安定した品質のためには厳格な同定が要求されており，種分類は必要不可欠である．麻黄は，発汗，解熱，鎮咳などの目的で，葛根湯や麻黄湯などの漢方処方に配合されている．また，特徴的な含有成分としてアルカロイドが知られており，エフェドリンをはじめ，プソイドエフェドリン，ノルエフェドリン，ノルプソイドエフェドリン，メチルエフェドリンなどがある．JP16 には総アルカロイド（エフェドリン及びプソイドエフェドリン）0.7%以上を含むと規定されている．麻黄の原植物は日本に自生していないため，資源は全て中国に依存している．しかし，中国では資源の保護，砂漠化防止のため，1999 年より未加工品の麻黄の輸出規制を行っている．その為，現在麻黄の供給は常に不安定な状態にある．このような状況から，新たな麻黄資源の確保が求められている．具体的な２つの選択肢は，①日本での原植物の栽培化，②中国以外の地域における代替種の開発，である．①について，栽培法が確立していない状況にある．②について，昭和 20-30 年代に中国からの輸入が途絶え，麻黄の供給が不安定になった．この際は，パキスタンやロシアなどから輸入されていた．すなわち②に関する検討の余地は大きく残されている．  	 本研究では，生薬麻黄の多方面にわたる供給地を確保することを目指し，E. equisetina 及び近縁植物の種分類と多様性を解明することを目的とした．JP16 には E. sinica，E. intermedia，E. equisetina の 3 種以外は認められない．しかし冒頭に記載のとおり種の位置づけが困難な Ephedra 属植物において，E. equisetina と E. major ssp. procera のように区別が確定していない種類がある．仮に両種が種として区別し得ない場合，E. major ssp. procera に由来する生薬も麻黄として利用できる可能性がある．実際，E. equisetina について，国際塩基配列データベース（DDBJ/EMBL/GenBank）に複数の配列多型が登録されていること，形態的な変異を考慮すると種内で大きな多様性を有する分類群であることが推察されている．すなわち，E. major ssp. procera は E. equisetina の種内の多様性に含まれる可能性が充分にある．この場合、E. major ssp. procera はユーラシア大陸西部に広く分布することから，麻黄の資源供給地の選択肢が大きく広がることになる． 【実験材料】 実験材料は以下の通りである． 2002 年から 2012 年の間に中国およびモンゴルで採集した E. equisetina 57 検体（新疆ウイグル自治区ウイグル自治区 32 検体，河北省 4 検体，青海省 5 検体，甘粛省 2 検体，内蒙古自治区 11 検体，モンゴル 3 検体） 2012 年にトルコおよびフランスで採集した E. major ssp. procera 24 検体（Karadiken 1 検体，Kaiseri 4 検体，Kirikkale 6 検体，Cappadocia 10 検体，Ankara 2 検体，フランス 1 検体） 【方法】 ・ DNA 解析 植物試料約 50 ~ 100 mg から 全 DNA を抽出し，PCR (polymerase chain reaction) 法により ITS 領域及び trn K 遺伝子を増幅した．塩基配列はジデオキシ法による直接塩基配列決定法によって決定した.  ・ アルカロイド分析 植物標本から草質茎を採取し，乾燥後粉末にした．移動相で抽出した後メンブランフィルタ （ー0.45 µm）で濾過し，試料溶液を調製した．HPLC 法により，エフェドリン（E），プソイドエフェドリン（PE），ノルエフェドリン（NE），ノルプソイドエフェドリン（NPE），メチルエフェドリン（ME）の含量をピーク面積から絶対検量線法で定量した． 【結果及び考察】 ・DNA 解析 １．E. equisetina の多様性に関して 今回使用した 57 検体の E. equisetina の ITS1 領域の DNA 配列は，2 タイプ確認された．一つは塩基配列番号 774 番目の塩基から重複が始まる検体であり，もう一つは 809 番目から重複が始まる検体であった．すなわち，全ての検体で異なる塩基が重複した配列が認められた．このような異なる塩基の重複した配列は別種間の交雑による可能性が推測される．例えば，774 番目から重複が始まる検体は，E. intermedia 又は E. sinica との雑種と推測される検体であり，新疆ウイグル自治区で 1 検体，モンゴルで 1 検体認められた．新疆ウイグル自治区には E. sinica が自生していないため，中国新疆ウイグル自治区の 1 検体は E. intermedia との雑種である可能性が高いと考えられる． 	 trn K 遺伝子の DNA 配列は，全ての検体で一致した．trn K は葉緑体遺伝子であることから，ITS1 領域の解析で雑種と推定された検体の母系は，E. equisetina である事が明らかになった．また，DDBJ に登録されているモンゴル産 E. equisetina（AB453795）と比較すると 2 塩基の変異が認められた．  ２．E. equisetina と E. major ssp. procera に関して 	 ITS1 領域の E. major ssp. procera と E. equisetina の DNA 配列を比較すると，E. equisetina に特有な異なる塩基の重複した配列（main peak, 2nd peak）のうち，どちらか一方の 809 番目のシトシンが欠損している事によって両種は区別が可能であった．しかし，両種の違いはこの 1 塩基のみであった．一方，E. major の基準亜種 E. major ssp. major (GU968557 アルジェリア産) と E. major ssp. procera を比較すると 71 塩基異なっていた． 以上，ITS1 領域を系統学的解析した結果，E. major ssp. procera は基準亜種の E. major ssp. major よりも E. equisetina と近縁関係にあることが明らかになった．  	 trn K 遺伝子の解析結果では E. major ssp. procera の種内に 10-11 塩基異なるジェノタイプ M-1，M-2 が認められた．M-1 は Kirikkale, Ankara の検体であり，M-2 は Karadiken, Kaiseri, Kirikkale, Cappadocia の検体であった．また，フランスで採集した E. major ssp. procera は M-2 に分類された．葉緑体 DNA は母性遺伝するため，E. major ssp. procera には少なくとも 2 系統の異なる母系が存在すると考えられる．また，フランス産 E. major ssp. procera が M-2 に分類された事から，地理的要因を考慮すると M-2 は地中海を中心とした種子散布によるクラスターである可能性が考えられる．形態的に E. major ssp. procera と同定される分類群には，ITS1 領域の DNA 配列は一致するが，trn K 遺伝子が大きく異る，すなわち，母系が異なる２系統が存在することが明らかになった． 	 同一種内の異なる母系の存在は過去にも報告されている．Kitani らは，中国産 E. intermedia の DNA 配列を解析した結果，18S rRNA 遺伝子は一致するが，trn K 遺伝子の配列に 38 塩基の挿入欠損を認めたと報告している．また，E. equisetina にも母系由来である葉緑体 chlB 遺伝子に多型（Type E1, E2）が存在することが報告されている．このように同一種内でも母系の DNA 配列が異なっている例は多くある．  	 そこで，E. major ssp. procera のジェノタイプ M-1, M-2 と E. equisetina を比較すると，M-1 とは 10 塩基， M-2 とは 20-21 塩基の違いが認められた． 	 以上，ITS1 領域，trn K 遺伝子の DNA 配列を解析した結果と，形態的な相似性と合わせると，E. equisetina と E. major ssp. procera のジェノタイプ M-1, M-2 は，種として区別し得ないと判断できる．  ・ アルカロイド分析 	 含有成分において，E. equisetina と E. major ssp. procera の草質茎（乾燥）は JP16 が規定する 0.7 %以上の総アルカロイドを含有していた．E. equisetina は JP16 収載品であり，E. major ssp. procera はトルコで地上茎をリウマチの疼痛に，果実を頭痛に使用されている．E. major ssp. procera の含有成分は JP16 の基準を満たしている為，日本での使用も今後検討する必要がある． 	 アルカロイド組成では，産地ごとに特徴が認められた．E. equisetina では新疆ウイグル自治区，河北省の検体では 5 種類のアルカロイドに対するエフェドリンの比率が 64%であるのに対して，青海省，甘粛省，内蒙古自治区，モンゴルでは 7~13％であった．Hong らは，アルカロイド組成によって E. sinica, E. intermedia, E. equisetina の 3 種を分類できると報告しているが，本研究での E. equisetina のエフェドリンの比率は，産地によって異なる結果となった．Hong らが使用した E. equisetina は新疆ウイグル自治区で採集したもののみであり，本研究での新疆ウイグル自治区における E. equisetina のエフェドリン割合も Hong らの結果と一致する．同様に，E. major ssp. procera では Kaiseri，Cappadocia の検体では，25~31％であるのに対して，Karadiken, Kirikkale, Ankara の検体では 0~1%であった．このように，両種は生育地によって生成するアルカロイドの比率が大きく異なることが明らかになった．アルカロイドの組成は遺伝的に支配されているため，E. equisetina 及び E. major ssp. procera は異なる遺伝背景を持った個体が各地域にクラスターを形成しているものと考えられる．なお，第一章で明らかになったジェノタイプとアルカロイドには相関は認められなかった． 	 アルカロイドの分析結果から，含有量および組成からも両分類群は区別できないことを支持する結果となった． 	 以上，本研究により E. equisetina 及び近縁植物の種分類と多様性を解明した．これにより，E. major ssp. procera の多様性は E. equisetina の種内における多様性に含まれることが明らかになった．すなわち E. major ssp. procera に由来する生薬も生薬麻黄として利用できる事を示した．E. major ssp. procera はヨーロッパ西部や，地中海の西側から中央アジアにかけて分布しているため，幅広い供給地が期待され，麻黄の安定供給につながると考えられる．      審査結果の要旨  	 漢方医療における重要生薬「麻黄（マオウ）」の資源は、その原植物であるEphedra sinica、E. intermedia、E. equisetina が日本に自生しないため、全て中国からの輸入に依存している。本研究は中国以外からの供給地を確保することが可能か否か検討したものである。ユーラシア大陸西部に分布する E. major ssp. procera は E. major の亜種と位置付けられているが、形態学的特徴はE. equisetinaに近く、分類学的な正確性が議論されている。E. major ssp. procera が E. equisetina と同種であることを示せば「麻黄」資源になり得る。 	 そこで発表者は特定 DNA 領域の配列とアルカロイド（エフェドリンおよびプソイドエフェドリン）の含量を比較した。核 ITS および葉緑体 trnK 領域を比較した結果、E. equisetina とされる分類群は雑種由来であり E. major ssp. procera と同じ配列を有することを明らかにした。アルカロイド含量および組成は変異幅が大きく両種を区別することはできなかった。これらの結果は E. equisetina の外部形態的な多様性を支持する結果であり、E. equisetina と E. major ssp. procera は種として区別できないことを明らかにした。	  	 以上、本研究はこれまで未解決であった E. equisetina と E. major ssp. procera を中心に多様性を解明し種分類を明らかにすることで、生薬「麻黄」の中国以外の供給地を確保することが可能であることを示した。これらの成果は学術的な重要性に加え、日本の漢方医療における貢献も大きく、審査委員会は本論文が博士（創薬科学）に値すると判断した。  