Regulated heterodimerization of nitric oxide sensitive guanylyl cyclase (NOsGC) in rat brain and the direct fusion of the subunits for in vitro analysis
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NOsGC) während der postnatalen Entwicklung im Rattenhirn untersucht. Unsere Untersuchungen zeigten, dass im Großhirn eine mangelnde Korrelation zwischen der Proteinexpression und Aktivität der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase existiert. Als Grund für diese fehlende Korrelation konnten wir eine verminderte Heterodimerisierung der a1- und ß1-Untereinheit im Großhirn von adulten Ratten identifizieren. Im Gegensatz dazu wurde die Heterodimerisierung im Kleinhirn während der postnatalen Entwicklung nicht verändert. Wir nehmen daher an, dass die Heterodimerisierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase ein regulierter Prozess ist, der sich während der postnatalen Entwicklung des Großhirns durch einen bislang unbekannten Mechanismus verändert. Dieser Regulationsmechanismus scheint spezifisch für das Großhirn zu sein, da er im Kleinhirn nicht auftritt.
In dem zweiten Teil dieser Arbeit haben wir für in vitro Untersuchungen ein Fusionskonstrukt aus den a-Untereinheiten und der ß1-Untereinheit generiert. Wir konnten damit zum ersten Mal zeigen, dass eine direkte Fusion des Carboxyterminus der ß1-Untereinheit mit dem Aminoterminus der a-Untereinheiten möglich ist und zu einem funktionellen Enzym führt. Die NOsGC Fusionskonstrukte unterscheiden sich in ihren biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften nicht wesentlich von den koexprimierten Heterodimeren der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass die NO- und hämunabhängigen Aktivatoren der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase Cinaciguat und Ataciguat die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase isoformenspezifisch aktiviert. Beide Pharmaka aktivieren die a1/ß1 Isoform der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase effektiver als die a2/ß1 Isoform.In the first part of the present work, we studied regulation and expression of NOsGC in brain of rats during postnatal development. We consistently observed a surprising decrease in cerebral NO sensitive enzyme activity in adult animals in spite of stable expression of NOsGC subunits. A reduction in heterodimerization of the a1 and ß1 subunit in cerebrum of adult animals was demonstrated by co-precipitation analysis. This explained the observed decrease in NOsGC activity in cerebrum of adult animals. We conclude that differing efficiencies in heterodimer formation may be an important reason for the lack of correlation between NOsGC protein expression and NOsGC activity that has been described previously. We suggest that heterodimerization of NOsGC is a regulated process that changes during cerebral postnatal development because of still unknown signaling mechanisms.
In the second part, we generated two different ''conjoined'' NOsGCs by the direct fusion of the subunits for in vitro analysis. Recent evidence suggests that homodimeric complexes of a and ß subunits exist in vivo and that these non-heterodimerizing subunits have a separate function from cGMP signaling. To isolate the effect of the a1/ß1 or a2/ß1 heterodimeric enzyme in over expression experiments from potential effects of non-heterodimerizing a1, ß1 or a2 subunits, we cloned constructs that guarantee a 1:1 stochiometry between a and ß subunits and rule out the presence of homodimers. The carboxy-terminus of the ß1 subunit was directly fused to the amino-terminus of either the a1 or a2 subunit. The two different ''conjoined'' NOsGCs faithfully reproduced the biochemical and pharmacological properties of the heterodimeric enzymes. Furthermore we showed for the first time that there is a difference between a1/ß1 and a2/ß1 isoform with respect to their pharmacological properties. The new drugs cinaciguat and ataciguat activate the a1/ß1 isoform more effectively than the a2/ß1 isoform
