Generierung von hochproduktiven CHO Zelllinien für die Produktion von rekombinanten Antikörpern durch die Verwendung optimierter Signalpeptide und eines neuartigen ER Stress basierten Selektionssystems

Abstract

The suitability of several signal peptides was tested in transiently transfected cell lines in the first part of this thesis. Two promising signal peptides were identified and these candidates were optimized by introducing specific mutations. After that, the performance of the best signal peptides was analyzed in stably transfected cell lines. Clones with a very high productivity were selected and their potency was evaluated in a fed-batch experiment. Three different very potent Signal peptides (B, E and E3) were identified as by this way which can be used to generate cell lines with clearly improved production rates (up to 4.0 g/L antibody in 13 days) suitable for commercial purposes. The aim of the second part of the present thesis was to establish a novel selection system based on ER stress, which allows the rapid identification and isolation of high-producers. Therefore, regulatory elements involved in ER stress responses were identified in various production clones. By using a Recombinase mediated cassette exchange approach, regulatory elements involved in ER stress responses (e.g.: ERSE I, ERSE II, UPRE and AARE) as well as ER stress regulated promoters (Calreticulin (CALR), Glucose-regulated Protein 78 kDa and 94 kDa (GRP78, GRP94)) and the intron-containing X-box binding protein 1 (XBP1) fragment were analyzed and a very strong correlation was observed between the amount of secreted antibody and the activity of the GRP78 Reporter construct. Furthermore, a selection system based on the GRP78 Promoter was tested. The obtained results indicate that the novel ER stress based selection system, developed during this thesis, should be suitable to identify and isolate clones expressing high amounts of antibody.Im ersten Teil der Arbeit wurde die Eignung verschiedener Signalpeptide zu Expressionssteigung in transient transfizierten Zelllinien getestet. Zwei vielversprechende Signalpeptide wurden auf diese Weise gefunden und danach durch spezifische Mutationen optimiert. Danach wurden stabile Zelllinien generiert und ihr Potenzial in Fed-batch Experimenten untersucht. Auf diese Weise wurden drei sehr starke Signalpeptide (B, E und E3) identifiziert, welche zur Erzeugung von kommerziellen Zelllinien mit erhöhter Produktivität (bis zu 4.0 g/L Antikörper in 13 Tagen) eingesetzt werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein neuartiges ER Stress basiertes Selektionssystem etabliert, welches die schnelle Identifizierung und Isolierung von hochproduktiven Klonen erlaubt. Dafür wurden vielversprechende regulatorische Elemente, welche in der ER Stress Regulation beteiligt sind, identifiziert. Mittels eines Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausches wurden regulatorischen Elemente welche in der ER Stress-Antwort involviert sind (z.B.: ERSE I, ERSE II, UPRE und AARE) ebenso wie ER stress regulierte Promotoren (Calreticulin (CALR), Glukose-reguliertes Protein 78 kDa und 94 kDa (GRP78, GRP94)) und das intron-enthaltende X-Box bindende Protein 1 (XBP1) analysiert und eine sehr starke Korrelation zwischen der sekretierten Antikörpermenge und der Aktivität des GRP78 Reportes festgestellt. Darüberhinaus wurde ein Selektionssystem basierend auf dem GRP78 Promoter getestet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass das in diese Arbeit neuentwickelte Selektionssystem geeignet ist hochproduktive Klone zu isolieren