LL-37, jedyna ludzka katelicydyna, jest amfipatycznym, kationowym peptydem bakteriobójczym, który zawiera 37 reszt aminokwasowych. Dojrzały peptyd uwalniany jest z 18 kDa białka prekursorowego (katelicydyny) przez proteazę-3 w neutrofilach lub przez proteazy serynowe z rodziny kallikrein w keratynocytach. Oprócz zdolności bezpośredniego zabijania mikroorganizmów, LL-37 pełni funkcję immunomodulacyjną. Jedną z nich jest tworzenie kompleksów z ujemnie naładowanymi oligonukleotydami pochodzącymi zarówno z obumierających komórek gospodarza, jak i patogenów. Interakcja ta ułatwia rozpoznawanie DNA przez receptory wewnątrzkomórkowe, takie jak TLR-9 prowadząc do indukcji odpowiedzi immunologicznej. W ostatnim czasie udokumentowano, że zdolność peptydu LL-37 do pełnienia funkcji bakteriobójczych i immunomodulacyjnych zależy w dużym stopniu od jego modyfikacji potranslacyjnych, wśród których deiminacja odgrywa wyjątkową rolę. Struktura pierwszorzędowa LL-37 zawiera pięć reszt argininy (Arg), które są wydajnie cytrulinowane przez deiminazy peptydylo-argininowe (PADs), enzymy, które są zależnymi od wapnia hydrolazami katalizującymi konwersję dodatnio naładowanej argininy do neutralnej cytruliny. W związku z powyższym w niniejszej pracy skupiono się na roli deiminacji peptydu LL-37 w regulacji odpowiedzi zapalnej na kwasy nukleinowe. Uzyskane wyniki dowiodły, że cytrulinacja LL-37 katalizowana przez PAD2 ogranicza zależne od peptydu pochłanianie DNA przez fagocyty. Co ciekawe, karbamylacja peptydu (homocytrulinacja reszt lizyny) nie ma wpływu na jego interakcję z DNA, tak długo jak karbamylowany peptyd nie zostanie poddany działaniu PAD2. W badaniach zastosowano również syntetyczny peptyd LL-37 z resztami Arg zastąpionymi homoargininą (hArg-LL-37), która jest niewrażliwa na proces enzymatycznej deiminacji przez PADy. Dane te wykazały, że wiązanie peptydu LL-37 z DNA, a tym samym jego działanie immunoregulacyjne względem fagocytów nie zależy wyłącznie od ładunku dodatniego peptydu, ale od prawidłowego rozmieszczenia guanidynowych łańcuchów bocznych argininy w natywnej sekwencji peptydu. Aby zbadać, czy powyższe zjawisko odgrywa rolę w stanie zapalnym przeprowadzono badania z wykorzystaniem zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs, ang. neutrophil extracellular traps). Tworzenie tych struktur, zbudowanych z nici genomowego DNA udekorowanych białkami pochodzącymi z ziaren azurofilnych, w tym LL-37, zależy od aktywności PAD4. Szczegółowa analiza składu NETs i ich wpływu na profesjonalne fagocyty sugeruje, że katelicydyna/LL-37 jest cytrulinowana przez PAD4 podczas tworzenia pułapek neutrofilowych. Proces ten odgrywa istotną rolę w kontroli potencjału zapalnego NETs, zwłaszcza w regulacji odpowiedzi immunologicznej na uwolnione z obumierających komórek DNA, które jest rozpoznawane przez receptor TLR9. Przebieg procesu cytrulinacji w warunkach in vivo potwierdzają wyniki analizy serologicznej surowic pochodzących od pacjentów cierpiących na przewlekłe choroby zapalne, takie jak: paradontozę i reumatoidalne zapalenie stawów, w których wykazano podwyższony poziom przeciwciał rozpoznających cytrulinowaną formę peptydu LL-37. Ostatecznie, dowiedziono, że cytrulinowana forma peptydu LL-37 zwiększa powstawanie NETs, co sugeruje mechanizm pozytywnego sprzężenia zwrotnego. Podsumowując, cytrulinacja peptydu LL-37 odgrywa kluczową rolę w jego immunomodulacyjnym działaniu przeciwdziałając utracie tolerancji gospodarza na własne cząsteczki, w tym DNA.LL-37, the only human cathelicidin, is an amphipathic, cationic antimicrobial peptide that contains 37 amino acids residues. The mature peptide is released from an 18-kDa precursor protein (cathelicidin) by protease-3 in neutrophils or by serine proteases of the kallikrein family in keratinocytes. Besides playing antimicrobial role, LL-37 exerts several immunomodulatory functions that regulate host responses to pathogens. Among them is formation of complexes with negatively charged oligonucleotides derived from both dying host cells and pathogens. Such interaction facilitates the recognition of DNA by intracellular receptors such as TLR9, thereby stimulating the immune response. It was recently documented that the ability of peptide to execute its bactericidal and immunomodulatory functions strongly depends on posttranslational modifications, among which enzymatic deimination (citrullination) of Arg residues plays a unique role. The primary structure of LL-37 contains five arginine (Arg) residues that are effectively citrullinated by peptidyl-arginine deiminases (PADs), enzymes that are calcium-dependent hydrolases catalyzing the conversion of positively charged arginine to neutral citrulline. Therefore, presented study focused on the role of LL-37 deimination in the regulation of the host immune response to nucleic acids. Presented data revealed that citrullination of LL-37 by PADs hindered peptide-dependent DNA uptake and sensing by pDCs. In contrast, carbamylation of the peptide (homocitrullination of lysine residues) had no effect on its interaction with DNA. This activity was abolished by citrullination of Arg residues in the peptide by PAD2. We implemented in the study the synthetic peptide LL-37 with Arg residues substituted by homoarginine (hArg-LL-37), which is insensitive to enzymatic deimination. Using such peptide, we observed that regardless of PAD2 treatment hArg-LL-37 preserved full biological activity. These data have showed that peptide binding to DNA and its immunoregulatory effects on myeloid cells do not depend entirely on the positive charge of LL-37 but on the proper distribution of guanidium side chains of Arg (or homo-Arg) in the native peptide sequence. To explore if above phenomenon plays a role in inflammatory conditions, we introduced in the study neutrophil extracellular traps (NETs). Formation of those structures, composed of genomic DNA and decorated with azurophilic proteins including LL-37, depends on PAD4 activity. Detailed analysis of NETs composition and their influence on myeloid cells suggest that cathelicidin/LL-37 is citrullinated by PADs during NETs formation. Such process makes a marked contribution to the inflammatory potential of NET structures especially in regulating the immunostimulatory response of cell-free DNA, which is mediated by TLR9. Such conclusion was additionally supported by an elevated antibody response against citrullinated LL-37 in blood serum obtained from patients suffering from chronic inflammatory diseases (periodontitis, rheumatoid arthritis). Finally, obtained data revealed that citrullinated LL-37 itself enhances the generation of NETs formation suggesting the mechanism of positive feedback. Taken together, by preventing the breakdown of tolerance to self-molecules, citrullination of LL-37 plays a critical role in immunomodulation of the host response
