Gođevac, Dejan

Central Repository of the Institute of Chemistry, Technology and Metallurgy (CER)

12 Hemijski pregledDEJAN GOÆEVAC, IHTM-centar za hemiju, Beograd, (dgodjev¼chem .bg.ac.yu)NOVIJE TEHNIKE U MASENOJ SPEKTROMETRIJI (I DEO)NOVI NAØINI JONIZACIJEUVODOd svog poøetka, pre stotinak godina, masenaspektrometrija postala je sveprisutno istraÿivaø-ko oruæe bez kojeg se ne moÿe zamisliti savremenanauka i struka: otkriõe izotopa, taøno odreæivañeatomskih masa, kvantitativna gasna analiza, brzaidentifikacija tragova zagaæivaøa i mnoge drugestvari savremene hemije. Veõ pedeset godina spek-trometrija masa je nezamençiva u organskoj hemijizbog kçuønog doprinosa odreæivañu strukture mo-lekula. Posle prvog zamaha, duÿe vremena je tehni-ka masene spektrometrije stagnirala, zato åto je utom  trenutku bilo nemoguõe analizirati molekulerelativne molekulske mase veõe od 1000. Zahvaçu-juõi novim tehnikama koje su prevaziåle ta ograni-øeña, masena spektrometrija se zadñih godina sveviåe primeñuje u biohemiji za prouøavañe bioma-kromolekula. Na slici 1 su u vidu blok åeme prika-zani osnovni delovi masenog spektrometra.Da bi bilo analiziralo u masenom  spektrome-tru, jediñeñe mora biti naelektrisano. Poåto suveõina organskih jediñeña neutralni molekuli, ne-ophodno ih je jonizovati u jonskom izvoru. Pored do-bijaña jednog ili viåe naelektrisaña po jednommolekulu, pri ovom procesu se øesto deåava frag-mentacija jona na nove jone, radikale i neutralnefragmente. Nadaçe, joni se putem  zagrevaña, de-sorpcije1 ili desolvatacije (a uz pomoõ snaÿnog va-kuum sistema) prevode u gasnu fazu. Poåto se ovajølanak bavi novijim naøinima jonizacije, vratiõe-mo se detaçnije ovome kasnije. Jone nastale takvim  naøina potrebno je anali-zirati prema odnosu masa/naelektrisañe (m/z) u ma-senom analizatoru. Postoji viåe naøina da se touradi. Kod klasiønog masenog analizatora joni senajpre ubrzaju u elektriønom poçu, a zatim usmerekroz homogeno magnetno poçe. Lorencova sila ihprimorava da skrenu sa pravolinijskog puta. Skre-tañe õe biti veõe ukoliko je masa jona maña, a nae-lektrisañe veõe. Na izlazu iz magnetnog poça po-stavçen je prorez kroz koji mogu proõi samo joni sataøno definisanim odnosom m/z. Da bi se dobio ma-seni spektar2 potrebno je postepeno meñati jaøinumagnetnog poça, tako da se po redu, svi joni (dakle ioni sa drugim vrednostima m/z) takoæe proåli krozprorez i zatim bili detektovani.Na  osnovu prouøavaña ponaåaña naelektri-sanih øestica u promençivom elektriønom  i mag-netnom poçu konstruisano je nekoliko tipova mase-nih analizatora: najpre kvadrupolni analizator, a unovije vreme jon-trap Š1Ð i analizator jon-ciklo-tron rezonancije (detaçnije videti u drugom deluølanka). Postoji i maseni analizator koji ne kori-sti nikakvo magnetno poçe, veõ funkcioniåe  naosnovu razliøite brzine preleta jona od jonskog iz-vora do detektora (“TOF = time of flight” detektor).On je jednostavne konstrukcije i sastoji se iz elek-triønog poça gde se ubrzavaju joni i jedne evakui-sane cevi kroz koju se kreõu ravnomerno pravoli-nijski. Do detektora u ovakvim instrumentima naj-pre stiÿu joni mañe mase, dok teÿi, poåto se kreõumañom brzinom, dolaze kasnije.Pokazalo se da su izvesni jonski izvori kompa-tibilni sa taøno odreæenim analizatorom. Zbog to-ga pored viåe tipova masenih analizatora, postojii viåe naøina jonizacije. Izbor jonskog izvora za-visi i od prirode uzorka i vrste informacija kojese ÿele dobiti. Najøeåõe se koriste sledeõi:• elektronski  udar (EI )• hemijska  jonizacija (CI)• desorpcija poçem  (FD)• bombardovañe  brzim atomima (FAB)• “matrix assisted laser desorption” (MALDI)• elektrosprej jonizacija (ESI)Metoda jonizacije elektronskim udarom spada utzv. “tvrde” metode zato åto se molekul uzorka jakofragmentiåe.U ovom jonskom izvoru se brzi  elek-troni sudaraju sa molekulima uzorka pri øemu izbi-jaju jedan elektron iz elektronskog omotaøa (dobijese radikal-katjon), a viåak prenete energije se ko-risti za fragmentaciju. Øesto se dobiju spektri ukojima izostaje molekulski jon, pa je za veõinu or-ganskih molekula nemoguõe na ovaj naøin odreditimolekulsku masu. Neåto “mekåa” je metoda hemij-ske jonizacije (vidi sliku 2). Kod ove tehnike nae-lektrisañe se prenosi posredno reakcijom sa joni-zovanim  gasom. Meæutim sa poveõañem  molekulskemase ispitivane supstance sve je teÿe dobiti mole-kulski jon. 1 Uzorak  moÿe biti  adsorbovan  na øvrstom nosaøu2 U masenom spektru  je na apscisi m/z vrednost,a na ordinati obilnost jonaSlika 1. Osnovni delovi  masenog spektrometra£îíñêèèçâîð   ÌàñåíèàíàëèçàòîðÄåòåêòîð¼îíàÑèñòåì çà îáðàäó ïîäàòàêàGodi{te 44. broj 6 (2003) 13Slika 2.  Maseni spektri 1-dekanola dobijenielektronskim udarom (EI), gore, i hemijskom joni-zacijom (CI), doleELEKTROSPREJ JONIZACIJA (ESI)Jediñeña sa velikom molekulskom  masom, kojateåko  isparavaju ili  se raspadaju na poviåenojtemperaturi nemoguõe je analizirati primenom  EIili CI jonizacije.Tako se za analizu  biomolekulamoraju koristiti joå “mekåe” metode, u prvom reduMALDI i elektrosprej jonizacija. Prednost ESI je utome åto je pogodna za povezivañe sa teønom hroma-tografijom, pa se sa velikom uspeånoåõu analizi-raju i jako komplikovane smeåe.Prve eksperimente sa  tehnikom elektrosprejjonizacije izveo je Øepman (Chapman) 1937. godineŠ2Ð, dok je Doul (Dole) 1968. prvi put primenio za ma-senu spektrometriju.Š3Ð Meæutim , pravi razvoj ESI-MS tehnike otpoøiñe osamdesetih godina proålogveka radovima Fena (Fenn) i Mana (Mann).Š4Ð Oni suuspeåno primenili ovu tehniku za jonizaciju veomavelikih molekula. Danas istraÿivøi koristeõi ESImogu jonizovati proteinske komplekse, ribozome,pa øak i øitave viruse.Š5Ð Zbog velikih zasluga zarazvitak elektrosprej jonizacije, Fen je 2002. godi-ne bio jedan od trojice dobitnika Nobelove nagradeza hemiju.PRINCIP  RADA ELEKTROSPREJ JONIZACIJEUzorak za analizu se u ESI  jonski izvor uvekunosi  rastvoren u pogodnom polarnom rastvaraøu,smeåi rastvaraøa ili puferu. Ovo je posebno po-godno za biomolekule, jer nema potrebe za mukotrp-nim izolovañem iz vodenog rastvora. Ako su u pita-ñu komplikovane smeåe, a ne øista jediñeña, tadase kolona visokoefikasne teøne hromatografije(HPLC) direktno povezuje sa sa ESI jonskim izvorom.Rastvor koji treba analizirati ubrizgava se umetalnu kapilaru koja se nalazi pod naponom od 2-5kV u odnosu na cilindriønu elektrodu (slika 3). Ra-stvor unutar kapilare postaje naelektrisan, pa sena izlazu iz kapilare raspråuje u sitne kapi usledodbijaña istoimenih naelektrisaña. Kapçice sa-drÿe kako molekule rastvaraøa, tako i molekuleispitivane supstance. Usled isparavaña rastvara-øa, potpomognutog strujom azota, kapçice postajusve mañe, a koncentracija istoimenog naelektri-saña na povråini kapçice sve veõa. Kada Kulonoveodbojne sile prevagnu nad povråinskim  naponom,kapçica se raspråi (“eksplodira”). Ova “Kulonskaeksplozija” pravi seriju mañih, a joå uvek jako nae-lektrisanih kapçica. Proces isparavaña i eksplo-zija se ponavça sve dok se analizirani molekul pot-puno ne oslobodi od molekula rastvaraøa i postane(najøeåõe) viåestruko naelektrisan jon.Slika 3. Åema elektrosprej jonskog izvoraJoni koje treba analizirati prolaze kroz maliotvor i preko komore u kojoj vlada visoki vakuumulaze u maseni analizator.ANALIZA ESI MASENOG SPEKTRA MIOGLOBINAESI je najmekåa metoda jonizacije koja se danaskoristi. Prvi spektri  makromolekula dobijeniovom tehnikom su jako zbuñivali nauønike. Bio jeprisutan veliki broj pikova, a ova “meka” metodanije trebala da proizvede mnogo raznovrsnih frag-mentacionih jona. Ubrzo  je razjaåñeno da ustvarimnoåtvo pikova ne potiøe od fragmenata razliøi-te mase, veõ od molekulskog jona sa razliøitim bro-jem naelektrisaña.Š6Ð Raznovrsnost i koliøina na-stalih jona zavisi od kiselo-baznih osobina mole-kula ispitivane supstance i rastvaraøa koji se ko-risti za pripremañe uzorka. Naelektrisañe moÿenastati protonovañem, deprotonovañem ili dodat-kom drugog jona (najøeåõe Na+, K+, Li+ koji mogu bi-ti prisutni u rastvaraøu-puferu i staklenm delo-vima aparature). Tako je i sa spektrom proteina mi-oglobina Š7Ð, prikazanom na slici 4:14 Hemijski pregledSlika 4. ESI maseni spektar mioglobinaSvi prisutni pikovi potiøu od viåestruko na-elektrisanog molekulskog jona, a ne od fragmenata.Molekul mioglobina se lako protonuje u prisustvukiselog pufera pri øemu nastaje serija viåestrukopozitivno naelektrisanih jona. Dakle, nemoguõe jeoøitati masu molekula direktno iz spektra (jer neznamo koliko naelektrisaña odgovara kojem piku),ali se moÿe izraøunati. Izabere se bilo koji pik ioznaøi se kao (M+n)/n. U brojiocu je masa jona, odno-sno masa molekula M uveõana za masu protona n, doku imeniocu n predstavça naelektrisañe jona. Su-sedni pik sa mañim  odnosom m/z odgovara jonu sajednim naelektrisañem viåe i masom uveõanom zajednu jedinicu, pa se oznaøava kao (M+n+1)/(n+1). Naprimer:Reåavañem ove dve jednaøine dobije se da je mo-lekulska masa 16954,5, a broj naelektrisaña za odgo-varajuõi pik je n=15. Da bi se izraøunala joå taøni-ja masa sliøne jednaøine se mogu postaviti za svakipik, a od dobijenih rezultata se raøuna sredña vred-nost.MASENA SPEKTROMETRIJA  VIRUSARazvoj elektrosprej jonizacije je znatno proåi-rio ulogu masene spektrometrije u raznim oblasti-ma hemije i biohemije. Na primer, omoguõeno je pro-uøavañe nekovalentnih interakcija izmeæu makro-molekula, prouøavañe uvijaña proteina i kao i in-terakcija izmeæu  proteina i virusnog proteina. Jedna grupa nauønika je 1996. godine uspela davirus koji izaziva mozaiønu bolest duvana (TMV)propusti kroz maseni spektrometar sa ESI izvorom.TMV je sastavçen od oko 2140 identiønih protein-skih subjedinica uvijenih u 300 nm dugu spiralupreønika 17 nm. U centralnom, cilindriønom delunalazi se lanac RNK od 6395 nukleotida. Dakle, øi-tav virus je bio jonizovan i, kao takav, proåao krozanalizator pod visokim vakuumom. Iznenaæujuõe, naizlazu  aparata  virus  je sakupçen neoåteõen, iuspeåno koriåõen da zarazi list duvana.Š8Ð Kada jeovaj eksperiment prvi put napravçen, bilo je teh-niøki nemoguõe registrovati masu reda  veliøinemiliona daltona, jer je to daleko prevazilazilomerni opseg instrumenta. Tek je 2000. godine razvi-jena tehnika po kojoj se mogu registrovati joni sa ja-ko velikim masama i brojem naelektrisaña. Po tojmetodi istovremeno se meri naelektrisañe i odnosmasa/naelektrisañe za svaki jon.Š9Ð Na sledeõe dve slike prikazani su u vidu histo-grama raspodele broja naelektrisaña  i masenispektar pomenutog virusa. Joni virusa poseduju 300do 1000 pozitivnih naelektrisaña nastalih proto-novañem baznih mesta. Slika 5. Histogram  koji prikazuje raspodelubroja naelektrisaña TMV-a koji je proåao krozESI-MSMaseni spektar TMV dao je mase izmeæu 39 i 42miliona dalton, åto je bilo u dobrom slagañu saizraøunatom molekulskom masom  koja iznosi 40,5miliona daltona. Joå uvek se radi na poboçåañutaønosti mereña.Slika 6. Histogram  koji prikazuje masenispektar TMV (na  apscisi su mase u milionimadaltona )Ovi rezultati otvaraju øitav niz moguõnosti zaprimenu ESI-MS za detekciju i identifikaciju vi-rusa, ñihove strukture i funkcije, pa i kliniøkuprimenu.LITERATURA1. D. Godjevac, Hemijski pregled, 44 (1), 2003, 2-62. S. Chapman , Physical Review, 10, 1937, pp184-1903. M. Dole, L.L. Mack, R.L Hines, Journal of ChemicalPhysics, 49, 1968, pp2240-2249nnM +=3,1131117,1060+++=nnMGodi{te 44. broj 6 (2003) 154. M. Yamashita, J.B Fenn , Journal of Physical Chemi-stry, 88, 1984, pp4451-44595. Schweizerische  Chemische Gesellschaft, Chimia, 57,2003, 73–736. J.B. Fenn , M. Mann, C.K. Meng, S.F. Wong, and C.M.Whitehouse, Science 246, 1989, 647. Methods in Enzymology, 193 , 1990, pp 4228. G. Siuzdak, B. Bothner, M. Yeager, C. Brugidou, C.MFauquet, K. Hoey, C.M Chang, Mass Spectrometry  andViral Analysis, Chemistry & Biology, 1996, 3, p.459. S. Fuerstenau, W. Benner, J. Thomas, C Brugidou, BBothner, G. Siuzdak, Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40,No. 3ÇIÇANA ÕITIÕ , Osnovna  åkola "Slobodan   Sekuliõ", UÿiceSCENARIO  ZA REALIZACIJU ØASA: BAZE (HIDROKSIDI)Razred: VIITip øasa: Obrada novog gradivaCiçevi øasa: 1. Da uøenici koristeõi prethodno znañe i isku-stvo i kroz jednostavne oglede nauøe svojstva,podelu i dobijañe baza.2. Da uøenici samostalno sastavçaju formule ba-za i da uoøavaju po øemu se baze razlikuju od dru-gih neorganskih jediñeña.Materijal:• Kartice  za podelu uøenika u grupe (asocija-cije sa pojmovima  vezanim za temu øasa)• Papiri  veõeg formata  (10 komada)• Nastavni listiõi sa zadacima• Posuæe, pribor i supstanceGlavni koraci:• Formirañe  grupa i rad u grupama• Izveåtavañe  grupa• Formirañe  ekspertskih  timova• Rad u grupama • Izveåtavañe  grupa i izvoæeñe zakçuøakaTok rada:Korak 1. Uøenici se dele u pet grupa izvlaøe-ñem kartica sa pojmovima koji se odnose na temu øa-sa (1. formula baza / OH-, 2. podela baza / Mg, 3. ra-stvorçivost baza / Ca, 4. svojstva baza / Na, 5. amoni-jak / NH3). Grupe dobijaju razliøite zadatke:I grupa (formula baza) – uøenici imaju zadatakda na osnovu opåte formule baza i objaåñeña da-tog na nastavnom listiõu sastave formule baza øijisu nazivi dati i da daju nazive bazama na osnovu za-datih formula;II grupa (podela baza) – uøenici imaju zadatak dana osnovu uputstva na nastavnom listiõu o podelibaza prema broju hidroksidnih grupa, svrstaju bazeøije su formule date u jednokisele, dvokisele i tro-kisele i da to prikaÿu tabelarno;  III grupa (rastvorçivost baza) – uøenici imajuzadatak da na osnovu ogleda i uputstva na nastavnomlistiõu izvedu zakçuøak o podeli baza prema ra-stvorçivosti (NaOH, Ca(OH)2, Fe(OH)3); IV grupa (svojstva baza) – uøenici dobijaju triepruvete sa rastvorom natrijum -hidrokisda i zada-tak da ispitaju i åematski prikaÿu promenu bojesledeõih indikatora u baznoj sredini: crveni lak-mus, metil-otanÿ i fenol-ftalein;V  grupa (amonijak) – uøenici imaju zadatak daputem ogleda ispitaju kako se meña boja indikatorau rastvoru amonijaka, da izvedu zakçuøak zaåto jeamonijak svrstan u baze i da prikaÿu hemijskim jed-naøinama dobijañe amonijaka i ñegovu reakciju savodom.Korak 2. Na osnovu izvedenih zakçuøaka uøeni-ci pripremaju izveåtaje na velikim papirima. Po-tom predstavnici grupa lepe izveåtaje na tablu, sa-opåtavaju rezultate rada ostalim grupama i odgova-raju na ñihova pitaña.Korak 3. Formirañe ekspertskih timova. Korak 4. Grupe dobijaju razliøite eksperimen-talne zadatke:I grupa (Na) – uøenici na osnovu ogleda (reakci-ja izmeæu natrijuma i vode) treba da izvedu zakçu-øak o naøinu dobijaña baza i da reakciju prikaÿuhemijskom jednaøinom;II grupa (Ca) – uøenici na osnovu ogleda (reakci-ja izmeæu kalcijum-oksida i vode) treba da izveduzakçuøak o naøinu dobijaña baza iz ñihovih anhi-drida i da reakciju prikaÿu hemijskom jednaøinom;III grupa (Mg) - uøenici na osnovu ogleda (sago-revañe magnezijuma i reakcija izmeæu nastalog pro-izvoda i vode) treba da izvedu zakçuøak o vezi metal® bazni oksid ® baza i da reakcije predstave hemij-skim jednaøinama;IV  grupa (NH3) - uøenici na osnovu ogleda (reak-cija izmeæu gvoÿæe(III)-hlorida i natrijum-hidrok-sida) treba da izvedu zakçuøak o naøinu dobijañaVESTI iz ÅKOLEVESTI za ÅKOLE

Novije tehnike u masenoj spektrometriji, I deo - novi načini jonizacije

 CER - Central Repository of the Institute of Chemistry;  Technology and Metallurgy

12 Hemijski pregled
DEJAN GOÆEVAC, IHTM-centar za hemiju, Beograd, (dgodjev¼chem .bg.ac.yu)
NOVIJE TEHNIKE U MASENOJ SPEKTROMETRIJI (I DEO)
NOVI NAØINI JONIZACIJE
UVOD
Od svog poøetka, pre stotinak godina, masena
spektrometrija postala je sveprisutno istraÿivaø-
ko oruæe bez kojeg se ne moÿe zamisliti savremena
nauka i struka: otkriõe izotopa, taøno odreæivañe
atomskih masa, kvantitativna gasna analiza, brza
identifikacija tragova zagaæivaøa i mnoge druge
stvari savremene hemije. Veõ pedeset godina spek-
trometrija masa je nezamençiva u organskoj hemiji
zbog kçuønog doprinosa odreæivañu strukture mo-
lekula. Posle prvog zamaha, duÿe vremena je tehni-
ka masene spektrometrije stagnirala, zato åto je u
tom  trenutku bilo nemoguõe analizirati molekule
relativne molekulske mase veõe od 1000. Zahvaçu-
juõi novim tehnikama koje su prevaziåle ta ograni-
øeña, masena spektrometrija se zadñih godina sve
viåe primeñuje u biohemiji za prouøavañe bioma-
kromolekula. Na slici 1 su u vidu blok åeme prika-
zani osnovni delovi masenog spektrometra.
Da bi bilo analiziralo u masenom  spektrome-
tru, jediñeñe mora biti naelektrisano. Poåto su
veõina organskih jediñeña neutralni molekuli, ne-
ophodno ih je jonizovati u jonskom izvoru. Pored do-
bijaña jednog ili viåe naelektrisaña po jednom
molekulu, pri ovom procesu se øesto deåava frag-
mentacija jona na nove jone, radikale i neutralne
fragmente. Nadaçe, joni se putem  zagrevaña, de-
sorpcije1 ili desolvatacije (a uz pomoõ snaÿnog va-
kuum sistema) prevode u gasnu fazu. Poåto se ovaj
ølanak bavi novijim naøinima jonizacije, vratiõe-
mo se detaçnije ovome kasnije. 
Jone nastale takvim  naøina potrebno je anali-
zirati prema odnosu masa/naelektrisañe (m/z) u ma-
senom analizatoru. Postoji viåe naøina da se to
uradi. Kod klasiønog masenog analizatora joni se
najpre ubrzaju u elektriønom poçu, a zatim usmere
kroz homogeno magnetno poçe. Lorencova sila ih
primorava da skrenu sa pravolinijskog puta. Skre-
tañe õe biti veõe ukoliko je masa jona maña, a nae-
lektrisañe veõe. Na izlazu iz magnetnog poça po-
stavçen je prorez kroz koji mogu proõi samo joni sa
taøno definisanim odnosom m/z. Da bi se dobio ma-
seni spektar2 potrebno je postepeno meñati jaøinu
magnetnog poça, tako da se po redu, svi joni (dakle i
oni sa drugim vrednostima m/z) takoæe proåli kroz
prorez i zatim bili detektovani.
Na  osnovu prouøavaña ponaåaña naelektri-
sanih øestica u promençivom elektriønom  i mag-
netnom poçu konstruisano je nekoliko tipova mase-
nih analizatora: najpre kvadrupolni analizator, a u
novije vreme jon-trap Š1Ð i analizator jon-ciklo-
tron rezonancije (detaçnije videti u drugom delu
ølanka). Postoji i maseni analizator koji ne kori-
sti nikakvo magnetno poçe, veõ funkcioniåe  na
osnovu razliøite brzine preleta jona od jonskog iz-
vora do detektora (“TOF = time of flight” detektor).
On je jednostavne konstrukcije i sastoji se iz elek-
triønog poça gde se ubrzavaju joni i jedne evakui-
sane cevi kroz koju se kreõu ravnomerno pravoli-
nijski. Do detektora u ovakvim instrumentima naj-
pre stiÿu joni mañe mase, dok teÿi, poåto se kreõu
mañom brzinom, dolaze kasnije.
Pokazalo se da su izvesni jonski izvori kompa-
tibilni sa taøno odreæenim analizatorom. Zbog to-
ga pored viåe tipova masenih analizatora, postoji
i viåe naøina jonizacije. Izbor jonskog izvora za-
visi i od prirode uzorka i vrste informacija koje
se ÿele dobiti. Najøeåõe se koriste sledeõi:
• elektronski  udar (EI )
• hemijska  jonizacija (CI)
• desorpcija poçem  (FD)
• bombardovañe  brzim atomima (FAB)
• “matrix assisted laser desorption” (MALDI)
• elektrosprej jonizacija (ESI)
Metoda jonizacije elektronskim udarom spada u
tzv. “tvrde” metode zato åto se molekul uzorka jako
fragmentiåe.U ovom jonskom izvoru se brzi  elek-
troni sudaraju sa molekulima uzorka pri øemu izbi-
jaju jedan elektron iz elektronskog omotaøa (dobije
se radikal-katjon), a viåak prenete energije se ko-
risti za fragmentaciju. Øesto se dobiju spektri u
kojima izostaje molekulski jon, pa je za veõinu or-
ganskih molekula nemoguõe na ovaj naøin odrediti
molekulsku masu. Neåto “mekåa” je metoda hemij-
ske jonizacije (vidi sliku 2). Kod ove tehnike nae-
lektrisañe se prenosi posredno reakcijom sa joni-
zovanim  gasom. Meæutim sa poveõañem  molekulske
mase ispitivane supstance sve je teÿe dobiti mole-
kulski jon. 
1 Uzorak  moÿe biti  adsorbovan  na øvrstom nosaøu
2 U masenom spektru  je na apscisi m/z vrednost,a na ordinati obilnost jona
Slika 1. Osnovni delovi  masenog spektrometra
£îíñêè
èçâîð
   Ìàñåíè
àíàëèçàòîð
Äåòåêòîð
¼îíà
Ñèñòåì çà îáðàäó
 ïîäàòàêà
Godi{te 44. broj 6 (2003) 13
Slika 2.  Maseni spektri 1-dekanola dobijeni
elektronskim udarom (EI), gore, i hemijskom joni-
zacijom (CI), dole
ELEKTROSPREJ JONIZACIJA (ESI)
Jediñeña sa velikom molekulskom  masom, koja
teåko  isparavaju ili  se raspadaju na poviåenoj
temperaturi nemoguõe je analizirati primenom  EI
ili CI jonizacije.Tako se za analizu  biomolekula
moraju koristiti joå “mekåe” metode, u prvom redu
MALDI i elektrosprej jonizacija. Prednost ESI je u
tome åto je pogodna za povezivañe sa teønom hroma-
tografijom, pa se sa velikom uspeånoåõu analizi-
raju i jako komplikovane smeåe.
Prve eksperimente sa  tehnikom elektrosprej
jonizacije izveo je Øepman (Chapman) 1937. godine
Š2Ð, dok je Doul (Dole) 1968. prvi put primenio za ma-
senu spektrometriju.Š3Ð Meæutim , pravi razvoj ESI-
MS tehnike otpoøiñe osamdesetih godina proålog
veka radovima Fena (Fenn) i Mana (Mann).Š4Ð Oni su
uspeåno primenili ovu tehniku za jonizaciju veoma
velikih molekula. Danas istraÿivøi koristeõi ESI
mogu jonizovati proteinske komplekse, ribozome,
pa øak i øitave viruse.Š5Ð Zbog velikih zasluga za
razvitak elektrosprej jonizacije, Fen je 2002. godi-
ne bio jedan od trojice dobitnika Nobelove nagrade
za hemiju.
PRINCIP  RADA ELEKTROSPREJ 
JONIZACIJE
Uzorak za analizu se u ESI  jonski izvor uvek
unosi  rastvoren u pogodnom polarnom rastvaraøu,
smeåi rastvaraøa ili puferu. Ovo je posebno po-
godno za biomolekule, jer nema potrebe za mukotrp-
nim izolovañem iz vodenog rastvora. Ako su u pita-
ñu komplikovane smeåe, a ne øista jediñeña, tada
se kolona visokoefikasne teøne hromatografije
(HPLC) direktno povezuje sa sa ESI jonskim izvorom.
Rastvor koji treba analizirati ubrizgava se u
metalnu kapilaru koja se nalazi pod naponom od 2-5
kV u odnosu na cilindriønu elektrodu (slika 3). Ra-
stvor unutar kapilare postaje naelektrisan, pa se
na izlazu iz kapilare raspråuje u sitne kapi usled
odbijaña istoimenih naelektrisaña. Kapçice sa-
drÿe kako molekule rastvaraøa, tako i molekule
ispitivane supstance. Usled isparavaña rastvara-
øa, potpomognutog strujom azota, kapçice postaju
sve mañe, a koncentracija istoimenog naelektri-
saña na povråini kapçice sve veõa. Kada Kulonove
odbojne sile prevagnu nad povråinskim  naponom,
kapçica se raspråi (“eksplodira”). Ova “Kulonska
eksplozija” pravi seriju mañih, a joå uvek jako nae-
lektrisanih kapçica. Proces isparavaña i eksplo-
zija se ponavça sve dok se analizirani molekul pot-
puno ne oslobodi od molekula rastvaraøa i postane
(najøeåõe) viåestruko naelektrisan jon.
Slika 3. Åema elektrosprej jonskog izvora
Joni koje treba analizirati prolaze kroz mali
otvor i preko komore u kojoj vlada visoki vakuum
ulaze u maseni analizator.
ANALIZA ESI MASENOG SPEKTRA 
MIOGLOBINA
ESI je najmekåa metoda jonizacije koja se danas
koristi. Prvi spektri  makromolekula dobijeni
ovom tehnikom su jako zbuñivali nauønike. Bio je
prisutan veliki broj pikova, a ova “meka” metoda
nije trebala da proizvede mnogo raznovrsnih frag-
mentacionih jona. Ubrzo  je razjaåñeno da ustvari
mnoåtvo pikova ne potiøe od fragmenata razliøi-
te mase, veõ od molekulskog jona sa razliøitim bro-
jem naelektrisaña.Š6Ð Raznovrsnost i koliøina na-
stalih jona zavisi od kiselo-baznih osobina mole-
kula ispitivane supstance i rastvaraøa koji se ko-
risti za pripremañe uzorka. Naelektrisañe moÿe
nastati protonovañem, deprotonovañem ili dodat-
kom drugog jona (najøeåõe Na+, K+, Li+ koji mogu bi-
ti prisutni u rastvaraøu-puferu i staklenm delo-
vima aparature). Tako je i sa spektrom proteina mi-
oglobina Š7Ð, prikazanom na slici 4:
14 Hemijski pregled
Slika 4. ESI maseni spektar mioglobina
Svi prisutni pikovi potiøu od viåestruko na-
elektrisanog molekulskog jona, a ne od fragmenata.
Molekul mioglobina se lako protonuje u prisustvu
kiselog pufera pri øemu nastaje serija viåestruko
pozitivno naelektrisanih jona. Dakle, nemoguõe je
oøitati masu molekula direktno iz spektra (jer ne
znamo koliko naelektrisaña odgovara kojem piku),
ali se moÿe izraøunati. Izabere se bilo koji pik i
oznaøi se kao (M+n)/n. U brojiocu je masa jona, odno-
sno masa molekula M uveõana za masu protona n, dok
u imeniocu n predstavça naelektrisañe jona. Su-
sedni pik sa mañim  odnosom m/z odgovara jonu sa
jednim naelektrisañem viåe i masom uveõanom za
jednu jedinicu, pa se oznaøava kao (M+n+1)/(n+1). Na
primer:
Reåavañem ove dve jednaøine dobije se da je mo-
lekulska masa 16954,5, a broj naelektrisaña za odgo-
varajuõi pik je n=15. Da bi se izraøunala joå taøni-
ja masa sliøne jednaøine se mogu postaviti za svaki
pik, a od dobijenih rezultata se raøuna sredña vred-
nost.
MASENA SPEKTROMETRIJA  VIRUSA
Razvoj elektrosprej jonizacije je znatno proåi-
rio ulogu masene spektrometrije u raznim oblasti-
ma hemije i biohemije. Na primer, omoguõeno je pro-
uøavañe nekovalentnih interakcija izmeæu makro-
molekula, prouøavañe uvijaña proteina i kao i in-
terakcija izmeæu  proteina i virusnog proteina. 
Jedna grupa nauønika je 1996. godine uspela da
virus koji izaziva mozaiønu bolest duvana (TMV)
propusti kroz maseni spektrometar sa ESI izvorom.
TMV je sastavçen od oko 2140 identiønih protein-
skih subjedinica uvijenih u 300 nm dugu spiralu
preønika 17 nm. U centralnom, cilindriønom delu
nalazi se lanac RNK od 6395 nukleotida. Dakle, øi-
tav virus je bio jonizovan i, kao takav, proåao kroz
analizator pod visokim vakuumom. Iznenaæujuõe, na
izlazu  aparata  virus  je sakupçen neoåteõen, i
uspeåno koriåõen da zarazi list duvana.Š8Ð Kada je
ovaj eksperiment prvi put napravçen, bilo je teh-
niøki nemoguõe registrovati masu reda  veliøine
miliona daltona, jer je to daleko prevazilazilo
merni opseg instrumenta. Tek je 2000. godine razvi-
jena tehnika po kojoj se mogu registrovati joni sa ja-
ko velikim masama i brojem naelektrisaña. Po toj
metodi istovremeno se meri naelektrisañe i odnos
masa/naelektrisañe za svaki jon.Š9Ð 
Na sledeõe dve slike prikazani su u vidu histo-
grama raspodele broja naelektrisaña  i maseni
spektar pomenutog virusa. Joni virusa poseduju 300
do 1000 pozitivnih naelektrisaña nastalih proto-
novañem baznih mesta. 
Slika 5. Histogram  koji prikazuje raspodelu
broja naelektrisaña TMV-a koji je proåao kroz
ESI-MS
Maseni spektar TMV dao je mase izmeæu 39 i 42
miliona dalton, åto je bilo u dobrom slagañu sa
izraøunatom molekulskom masom  koja iznosi 40,5
miliona daltona. Joå uvek se radi na poboçåañu
taønosti mereña.
Slika 6. Histogram  koji prikazuje maseni
spektar TMV (na  apscisi su mase u milionima
daltona )
Ovi rezultati otvaraju øitav niz moguõnosti za
primenu ESI-MS za detekciju i identifikaciju vi-
rusa, ñihove strukture i funkcije, pa i kliniøku
primenu.
LITERATURA
1. D. Godjevac, Hemijski pregled, 44 (1), 2003, 2-6
2. S. Chapman , Physical Review, 10, 1937, pp184-190
3. M. Dole, L.L. Mack, R.L Hines, Journal of Chemical
Physics, 49, 1968, pp2240-2249
n
nM +=3,1131
1
1
7,1060
+
++
=
n
nM
Godi{te 44. broj 6 (2003) 15
4. M. Yamashita, J.B Fenn , Journal of Physical Chemi-
stry, 88, 1984, pp4451-4459
5. Schweizerische  Chemische Gesellschaft, Chimia, 57,
2003, 73–73
6. J.B. Fenn , M. Mann, C.K. Meng, S.F. Wong, and C.M.
Whitehouse, Science 246, 1989, 64
7. Methods in Enzymology, 193 , 1990, pp 422
8. G. Siuzdak, B. Bothner, M. Yeager, C. Brugidou, C.M
Fauquet, K. Hoey, C.M Chang, Mass Spectrometry  and
Viral Analysis, Chemistry & Biology, 1996, 3, p.45
9. S. Fuerstenau, W. Benner, J. Thomas, C Brugidou, B
Bothner, G. Siuzdak, Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40,
No. 3
ÇIÇANA ÕITIÕ , Osnovna  åkola "Slobodan   Sekuliõ", Uÿice
SCENARIO  ZA REALIZACIJU ØASA: BAZE (HIDROKSIDI)
Razred: VII
Tip øasa: Obrada novog gradiva
Ciçevi øasa: 
1. Da uøenici koristeõi prethodno znañe i isku-
stvo i kroz jednostavne oglede nauøe svojstva,
podelu i dobijañe baza.
2. Da uøenici samostalno sastavçaju formule ba-
za i da uoøavaju po øemu se baze razlikuju od dru-
gih neorganskih jediñeña.
Materijal:
• Kartice  za podelu uøenika u grupe (asocija-
cije sa pojmovima  vezanim za temu øasa)
• Papiri  veõeg formata  (10 komada)
• Nastavni listiõi sa zadacima
• Posuæe, pribor i supstance
Glavni koraci:
• Formirañe  grupa i rad u grupama
• Izveåtavañe  grupa
• Formirañe  ekspertskih  timova
• Rad u grupama 
• Izveåtavañe  grupa i izvoæeñe zakçuøaka
Tok rada:
Korak 1. Uøenici se dele u pet grupa izvlaøe-
ñem kartica sa pojmovima koji se odnose na temu øa-
sa (1. formula baza / OH-, 2. podela baza / Mg, 3. ra-
stvorçivost baza / Ca, 4. svojstva baza / Na, 5. amoni-
jak / NH3). Grupe dobijaju razliøite zadatke:
I grupa (formula baza) – uøenici imaju zadatak
da na osnovu opåte formule baza i objaåñeña da-
tog na nastavnom listiõu sastave formule baza øiji
su nazivi dati i da daju nazive bazama na osnovu za-
datih formula;
II grupa (podela baza) – uøenici imaju zadatak da
na osnovu uputstva na nastavnom listiõu o podeli
baza prema broju hidroksidnih grupa, svrstaju baze
øije su formule date u jednokisele, dvokisele i tro-
kisele i da to prikaÿu tabelarno;  
III grupa (rastvorçivost baza) – uøenici imaju
zadatak da na osnovu ogleda i uputstva na nastavnom
listiõu izvedu zakçuøak o podeli baza prema ra-
stvorçivosti (NaOH, Ca(OH)2, Fe(OH)3); 
IV grupa (svojstva baza) – uøenici dobijaju tri
epruvete sa rastvorom natrijum -hidrokisda i zada-
tak da ispitaju i åematski prikaÿu promenu boje
sledeõih indikatora u baznoj sredini: crveni lak-
mus, metil-otanÿ i fenol-ftalein;
V  grupa (amonijak) – uøenici imaju zadatak da
putem ogleda ispitaju kako se meña boja indikatora
u rastvoru amonijaka, da izvedu zakçuøak zaåto je
amonijak svrstan u baze i da prikaÿu hemijskim jed-
naøinama dobijañe amonijaka i ñegovu reakciju sa
vodom.
Korak 2. Na osnovu izvedenih zakçuøaka uøeni-
ci pripremaju izveåtaje na velikim papirima. Po-
tom predstavnici grupa lepe izveåtaje na tablu, sa-
opåtavaju rezultate rada ostalim grupama i odgova-
raju na ñihova pitaña.
Korak 3. Formirañe ekspertskih timova. 
Korak 4. Grupe dobijaju razliøite eksperimen-
talne zadatke:
I grupa (Na) – uøenici na osnovu ogleda (reakci-
ja izmeæu natrijuma i vode) treba da izvedu zakçu-
øak o naøinu dobijaña baza i da reakciju prikaÿu
hemijskom jednaøinom;
II grupa (Ca) – uøenici na osnovu ogleda (reakci-
ja izmeæu kalcijum-oksida i vode) treba da izvedu
zakçuøak o naøinu dobijaña baza iz ñihovih anhi-
drida i da reakciju prikaÿu hemijskom jednaøinom;
III grupa (Mg) - uøenici na osnovu ogleda (sago-
revañe magnezijuma i reakcija izmeæu nastalog pro-
izvoda i vode) treba da izvedu zakçuøak o vezi metal
® bazni oksid ® baza i da reakcije predstave hemij-
skim jednaøinama;
IV  grupa (NH3) - uøenici na osnovu ogleda (reak-
cija izmeæu gvoÿæe(III)-hlorida i natrijum-hidrok-
sida) treba da izvedu zakçuøak o naøinu dobijaña
VESTI iz ÅKOLE
VESTI za ÅKOLE


Croatian

http://cer.ihtm.bg.ac.rs//bitstream/id/7925/144.pdf

Novije tehnike u masenoj spektrometriji, I deo - novi načini jonizacije

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Central Repository of the Institute of Chemistry, Technology and Metallurgy (CER)

CER - Central Repository of the Institute of Chemistry; Technology and Metallurgy