Mechanisms of novel Hsp70 inhibitors and the co-chaperone Hsp110

Abstract

Hsp70 is a ubiquitously expressed molecular chaperone and required for maintaining protein homeostasis. Hsp70 is also highly upregulated in many cancer cells and important for their survival. Therefore, small molecule inhibitors are being developed for clinical use. Of those that are available currently, most, if not all, have poor potency, specificity or off-target effects. Thus, there is a need for specific Hsp70 inhibitors. Our collaborators developed a novel inhibitor of Hsp70 called YK5 (YK-series), which was effective at killing cancer cells. YK5 interacts with an allosteric interaction site which contains a cysteine residue where it binds covalently. I established a cellular assay for the Hsp70-mediated protein folding and solubilization and show that YK5 indeed disrupts the core biochemical functions of Hsp70. Hsp70 is an ATP-dependent molecular chaperone with a cycle that requires an ATPase stimulating DNAJ protein and a nucleotide exchange factor, NEF, to displace ADP. These changes in the nucleotide state in the nucleotide-binding domain drive the conformational changes in the substrate-binding domain. In the ATP-bound state, Hsp70 does not bind substrate, whereas in the ADP or apo-state, it does. Understanding how the YK inhibitors affect Hsp70 is important, especially when using them as tools to study biological functions of Hsp70. I show that the reversible analog of YK5, 17l, increases peptide binding to Hsc70 and Hsp70 in the core ATPase cycle. The effects are on the kinetics of substrate release, but also for Hsc70 in the equilibrium between substrate free and bound states. However, with the NEF Hsp110 present in the cycle, peptide binding to Hsc70 and Hsp70 decreases due to faster dissociation of Hsp110 caused by 17l. In both cases, there is a disruption of the ATPase cycle, which affects the ability of the Hsp70s to fold and solubilize substrate, an effect we observed in cells. The mechanistic effects of 17l on substrate interaction suggested the importance of the Hsp70 chaperone complex, as a whole, specifically with Hsp110. First, I show that Hsp110 is indeed important for folding and solubilization of substrate in cells and cannot be substituted by the Bag family of NEFs. I specifically addressed the importance of the Hsp70-Hsp110 interaction by designing a mutant of Hsp70 predicted to lose interaction with Hsp110; Hsp70-R301E. With this mutant, I show the first direct evidence for the importance of this interaction for folding and solubilization of substrate by Hsp70 in cells. I then show that the disaggregation of a mutant implicated in amyotrophic lateral sclerosis, SOD1-G85R, is dependent on a mechanism involving Hsp70 and Hsp110. Overall, this work demonstrates the direct importance of the Hsp70-Hsp110 interaction in cells for Hsp70 chaperoning functions.Hsp70 est un chaperon moléculaire exprimé ubiquiteusement et nécessaire au maintien de l'homéostasie des protéines. Hsp70 est également régulé à la hausse dans plusieures des cellules cancéreuses et important pour leur survie. C'est pourquoi des petites molécules inhibitrices sont en développement pour une utilisation clinique. La quasi-totalité de ces inhibiteurs disponibles à ce jour ont une activité et spécificité très basse et ont des effets non-ciblés. C'est pourquoi il y a un besoin d'inhibiteurs spécifiques de Hsp70. Nos collaborateurs ont développé un nouvel inhibiteur de Hsp70; YK5 (série YK) qui s'est avéré être efficace à tuer des cellules cancéreuses. YK5 interagit en se liant d'une manière covalente au résidu cystéine d'un site allostérique. J'ai établi un test cellulaire de pliage et de solubilisation des agrégats protéique (les deux dépendant de Hsp70) et j'ai démontré que YK5 perturbe en effet les fonctions biochimiques essentielles de Hsp70. Hsp70 est un chaperon moléculaire qui dépend de l'ATP et qui nécessite la protéine DNAJ (qui stimule l'ATPase) ainsi que le facteur d'échange de nucléotides NEF, pour déloger l'ADP. Ces changements de nucléotide dans le domaine de liaison de nucléotides entraînent les changements conformationnels du domaine de liaison du substrat. Dans son état de liaison avec l'ATP, Hsp70 ne se lie pas à un substrat tandis que dans l'état de liaison avec l'ADP ou l'état-apo il se lie à un substrat. La compréhension du mécanisme par lequel les inhibiteurs YK affectent Hsp70 est importante, surtout dans le contexte de leur utilisation comme des outils moléculaires pour l'étude des fonctions biologiques de Hsp70. Je démontre que l'analogue réversible de YK5, 171, augmente la liaison du peptide à Hsc70 et à Hsp70 dans le cœur du cycle de l'ATPase. Les effets sont dûs à la cinétique de la libération du substrat, mais également, pour Hsc70, à l'équilibre entre les états de substrat libre et de substrat lié. Par contre, avec le NEF Hsp110 présent dans le cycle, la liaison du peptide avec Hsc70 et Hsp70 diminue en conséquence de la dissociation plus rapide de Hsp110 causé par 171. Dans les deux cas, il y a perturbation du cycle de l'ATPase, ce qui affecte la capacité des Hsp70s à plier et solubiliser le substrat, un effet observable dans les cellules. Les effets mécanistiques de 171 sur l'interaction avec le substrat suggéraient l'importance du complexe chaperon Hsp70, dans son entièreté, spécifiquement en conjonction avec Hsp110. Premièrement, je démontre que Hsp110 est en effet important pour le pliage et la solubilisation du substrat dans les cellules et ne peut être substitué par la famille BAG des NEFs. J'ai spécifiquement adressé l'importance de l'interaction Hsp70-Hsp110 en produisant un mutant de Hsp70 conçu pour perdre l'interaction avec Hsp110; Hsp70-R301E. Avec ce mutant je démontre la toute première preuve directe de l'importance de cette interaction pour le pliage et la solubilisation du substrat par Hsp70 dans les cellules. Par la suite, je démontre que la désagrégation du mutant SOD1-G85R, qui est impliqué dans la sclérose amyotropique latérale, est dépendante d'un méchanisme qui implique Hsp70 et Hsp110. Dans son ensemble, mon travail démontre l'importance directe de l'intéraction Hsp70-Hsp110 pour les fonctions cellulaires de chaperon de Hsp70