Anàlisi de l'estructura de la cromatina del complex bitòrax de Drosophila melanogaster i contribució de les proteïnes dSAP18 i GAGA en la seva regulació
Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaEls gens homeòtics són els responsables del correcte desenvolupament dels organismes. A Drosophila, aquests gens es troben agrupats en dos clusters: el Complex Antenapèdia i el Complex Bitòrax (BX-C). El BX-C codifica per a tres gens homeòtics: l'Ultrabithorax, l'Abdominal A i l'Abdominal-B (Abd-B). L'expressió de l'Abd-B està conduïda per quatre dominis reguladors (iab-5 a iab-8) que controlen la seva expressió en els segments posteriors de l'organisme. En aquest treball, ens hem centrat en l'estudi dels elements reguladors que controlen l'expressió del l'Abd-B i en la contribució de les proteïnes dSAP18 i GAGA a la seva regulació. En primer lloc, assajos de digestió amb DNasaI realitzats a embrions de Drosophila ens han permès identificar diverses regions hipersensibles entre els dominis iab-5 i iab-6, suggerint l'existència de diversos elements reguladors en aquesta regió. Mitjançant un sistema en que el gen reporter white és control·lat pel seu propi promotor i enhancer, vam observar que la regió hipersensible més proximal promovia silenciament i Pairing-Sensitive Silencing (PSS) de l'expressió del gen reporter. Tant el silenciament com el PSS depenien de proteïnes del Grup Polycomb (Pc-G), indicant que aquesta regió actua com a un PRE (Polycomb Response Element). Hem anomenat aquesta regió iab6PRE. D'altra banda, hem observat que l'existència de regions lliures de nucleosomes als elements reguladors del BX-C és una característica molt conservada al llarg del desenvolupament de la mosca; també hi són presents a elements reguladors ectòpics i no depenen ni de l'estat transcripcional de la regió ni en el recrutament de proteïnes Pc i Trithorax (Trx) als PREs. No obstant, aquests llocs hipersensibles només estan presents a elements reguladors actius, ja que l'iniciador IAB6, que està implicat en la regulació del gen homèotic al principi del desenvolupament, mostra llocs lliures de nucleosomes a embrió, però no durant el desenvolupament larvari. Per tal d'analitzar l'organització nuclear del BX-C hem realitzat assajos de Chromosome Conformation Capture a cèl·lules S2 de Drosophila, que no expressen el gen Abd-B. Vam observar que l'element iab6PRE contacta amb el promotor del gen homeòtic així com amb d'altres elements de manteniment del complex, com l'MCP i el bxdPRE. L'element iniciador IAB6, en canvi, que es troba localitzat a només 5 Kb de l'iab6PRE, no interacciona amb cap d'aquests elements reguladors, suggerint que els elements de manteniment poden interaccionar a través de la formació de loops de cromatina. A més a més, hem vist que mosques mutants per a la proteïna dSAP18 mostren una disminució del silenciament conduït pels elements Fab-7 i iab7PRE en còpies ectòpiques; no obstant, aquesta disminució no és deguda ni a un canvi a les modificacions de les histones ni del patró de posicionament dels nucleosomes. Finalment, hem vist que una disminució de la quantitat de la proteïna GAGA mitjançant la inducció d'RNAs d'interferència a estadis tardans del desenvolupament larvari, promou la transformació homèotica del segment A6 a l'A5, suggerint una desregulació de l'expressió de l'Abd-B al segment A6. Aquesta desregulació indica que els patrons d'expressió establerts per les proteïnes Pc i Trx poden canviar al llarg del desenolupament de la mosca. No obstant, hem vist que la transformació tampoc és deguda a cap canvi en el patró d'hipersensibilitats a DNasaI ni a l'element Fab-7 ni a l'iab6PRE.The homeotic genes are responsible for the correct development of the organisms. In Drosophila, these genes are clustered in two complexes: the Antenapedia Complex and the Bithorax Complex (BX-C). The BX-C encodes for three homeotic genes: Ultrabithorax, Abdominal-A and Abdominal-B (Abd-B). The expression of the Abd-B is driven by 4 regulatory domains (iab-5 to iab-8), which control its expression at the most posterior segments of the organism. In this work, we have focused on the study of the regulatory elements that control Abd-B expression and the contribution of the dSAP18 and GAGA proteins to its regulation. First of all, DNaseI digestion assays performed in Drosophila embryos have allowed us to identify some hypersensitive regions among iab-5 and iab-6 domains, suggesting the existence of several regulatory elements within this region. By means of a reporter gene system in which the white gene was controlled by its own promoter and enhancer, we observed that the most proximal hypersensitive region promotes silencing and Pairing-Sensitive Silencing (PSS) of the reporter gene expression. Both silencing and PSS depend on Polycomb Group (Pc-G) proteins, indicating that this region acts as a PRE (Polycomb Response Element). We have named this region iab6PRE. On the other hand, we have observed that the existence of nucleosome-free regions on regulatory elements of the BX-C is a very conserved feature along the fly development; they are also present in ectopic regulatory elements and they do not depend either on the transcriptional state of the region or on the Pc and Trithorax (Trx) recruitment to PREs. However, these hypersensitive sites are present only at active regulatory elements, since the iniciator IAB6, which is implicated in the homeotic gene regulation at the beginning of the development, shows nucleosome free regions at embryo state, but not later during larval development. In order to analyse the nuclear organization of the BX-C, we have done Chromosome Conformation Capture assays in Drosophila S2 cells, which don't express the Abd-B gene. We observed that the iab6PRE element contacts with the homeotic gene promoter as well as with other maintenance elements of the complex, such as the MCP and the bxdPRE. The iniciator element IAB6, on the other hand, which is just located 5 Kb far from the iab6PRE, does not interact with any of these regulatory elements, suggesting that the maintenance elements may interact through the formation of chromatin loops. Furthermore, we have seen that dSAP18 mutant flies show a decrease in the silencing driven by Fab-7 and iab7PRE elements in ectopic copies; however, this decrease is not due to any change either in histone modification or in nucleosome position patterns. Finally, we have observed that a decrease in the amount of GAGA protein by inducing interference RNAs at later stages of larval development, promotes a homeotic transformation of the A6 segment to A5, suggesting a misregulation of the Abd-B expression in the A6 segment. This misregulation indicates that the expression patterns established by Pc and Trx proteins may change along the fly development. However, we have seen that the transformation is not due to any change in the DNaseI hypersensitive pattern neither of the Fab-7 nor of the iab6PRE elements
