Archaeal type IV prepilin-like signal peptidases: substrates and biochemistry

Abstract

De wereld van de micro-organismen is oneindig en fascinerend. Voor ons is deze wereld echter nauwelijks waar te nemen. Micro-organismen zijn met het blote oog niet te zien, maar ze laten op vele manieren hun sporen achter. Denk aan de manier waarop yoghurt en kaas wordt gemaakt, of de heerlijke boslucht na een regenbui, en de bontgekleurde waterbronnen in het Yellowstone National Park. Maar er zijn ook onaangename dingen zoals het bederven van voedsel, of een steenpuist. De grote uitdaging voor microbiologen is om het onzichtbare zichtbaar te maken, om uit indirecte waarnemingen conclusies te trekken over het leven dat zich afspeelt op een schaal van enige duizendste van een millimeter. Een bijzondere groep micro-organismen zijn de archaea (enkelvoud archaeon), die tijdens de evolutie als derde groep naast de bacteriën en eukaryoten zijn ontstaan. De groep (of het domein) van de Archaea werd voor het eerst eind jaren ’70 door Carl Woese en George Fox gedefinieerd op grond van moleculair DNA-onderzoek naar het zogenaamde kleine ribosomale deel. Archaea zijn met behulp van klassieke methoden (bijvoorbeeld met een microscoop) niet of nauwelijks van bacteriën te onderscheiden. Daarom is er nog steeds een discussie over de vraag of archaea werkelijk als een eigen grote groep van micro-organismen geclassificeerd kunnen worden. Een aantal wetenschappers denkt dat archaea alleen een groep van “exotische” bacteriën zijn. Overal waar leven is, zijn archaea te vinden, maar ook onder – voor de mens – vijandige omstandigheden kunnen veel soorten archaea gedijen. Bijvoorbeeld bij zeer hoge of lage temperaturen, in een sterk zure of basische omgeving of bij een hoge zoutconcentratie. De organismen die hier kunnen leven noemt men extremofielen. Deze extreme archaea zijn onder andere te vinden op bijzondere plekken zoals de Dode Zee en nabij vulkanische bronnen. Het organisme waarmee het meeste onderzoek is gedaan en dat in dit proefschrift beschreven wordt is Sulfolobus solfataricus. Leden van het geslacht Sulfolobus zijn wereldwijd te vinden in hete, zure, vulkanische bronnen. De soort Sulfolobus solfataricus werd bijvoorbeeld voor het eerst geïsoleerd in vulkanische gebieden rond Napels (Pozzuoli Solfatara) en uit heetwater bronnen in het Yellowstone National Park. Zowel in het veld als in het laboratorium zijn de optimale groeiomstandigheden voor deze archaea buitengewoon extreem: het temperatuuroptimum ligt ongeveer bij 80°C en door de aanwezigheid van zwavelzuur is de zuurtegraad (pH) van de bron 2 tot 3. Citroensap en azijn hebben ook ongeveer een pH van 3. Hoe kan Sulfolobus onder deze omstandigheden overleven? Hiervoor zijn twee belangrijke eigenschappen van de Sulfolobus-cel van grote betekenis: ten eerste is het celmembraan zeer ondoorlaatbaar voor zuren. Op die manier kan binnenin de cel een nagenoeg neutrale pH-waarde (zuur noch basisch) in stand gehouden worden. Ten tweede zijn de eiwitmoleculen van deze organismen zeer hittebestendig. In dit proefschrift staan drie klassen van membraaneiwitten centraal: 1. Transporteiwitten (zogenaamde „ABC-Transporters“), die voedingsstoffen herkennen en de cel inpompen. Bepaalde ABC-Transporters van Sulfolobus solfataricus werken samen met „bindingseiwitten“, die suikermoleculen kunnen vangen en doorgeven aan het transporteiwit, dat ze de cel inpompt. 2. Flagelline-eiwitten. Duizenden flagelline-eiwitten worden aan het celoppervlak in elkaar gezet tot schroefvormige scheepstouwachtige structuren (de zogenoemde flagellen), die draaien als een propeller. Op die manier kan de cel zwemmen. 3. De eerste circa 20 aminozuren van flagel- en bindingseiwitten vormen een zogenaamd signaalpeptide. Het signaalpeptide is nodig voor het inbouwen van het eiwit in het membraan in de juiste oriëntatie. Er zijn verschillende klassen signaalpeptiden, waarvan in het in dit proefschrift beschreven werk het zogenaamde klasse III signaalpeptide van belang is (zie afbeelding voor de verschillende klassen). Voordat de flagel- en bindingseiwitten hun functie kunnen uitoefenen, moet het signaalpeptide verwijderd worden. Hiervoor is een zogenaamd signaalpeptidase verantwoordelijk (de suffix –ase geeft aan dat het een enzym is dat in dit geval signaalpeptiden afsplitst). Het signaalpeptide kan gezien worden als een soort adreslabel waarmee een eiwit op de juiste plaats in de cel kan worden afgeleverd. Bij het membraan aangekomen, wordt dit adreslabel door het signaalpeptidase verwijderd. De nadruk van het onderzoek zoals beschreven in dit proefschrift lag op de identificatie en karakterisering van het onder punt drie beschreven signaalpeptidase (zie ook hoofdstukken 2 en 3). De genoomsequentie (de „tekst“ van het DNA-molecuul in de cel) en daarmee alle genen van Sulfolobus solfataricus zijn bekend en in databanken via het internet vrij toegankelijk. Met behulp van computerprogramma’s werd uit deze 3000 genen één gen uitgezocht, dat het meest leek op bekende signaalpeptidasen. Dit was gen SSO0131. Om vast te stellen dat gen SSO0131 inderdaad een signaalpeptidase was, werd het gen geïsoleerd en ingebracht in een colibacterie. Dit was noodzakelijk omdat Sulfolobus-cellen met de gangbare moleculair biologische methoden niet of slechts heel moeilijk gemanipuleerd kunnen worden. Echter, de colibacteriën zijn de zogenaamde “huisdieren” van de moleculaire biologie, omdat deze bacteriën zeer eenvoudig in het laboratorium gekweekt kunnen worden en doormiddel van goed ontwikkelde technieken genetisch manipuleerbaar zijn Het is ons gelukt om colibacteriën te “dwingen” om het eiwit te produceren dat door gen SSO0131 wordt gecodeerd. Zoals verwacht, vonden we dit eiwit in het membraan van de bacteriën terug. Met in vitro methoden kunnen we laten zien dat eiwit SSO0131 (later tot PibD „omgedoopt“) van zowel flagel- als bindingseiwitten het signaalpeptide kan afhalen (Figuur 1). Daarna werd nader onderzocht hoe PibD precies werkt (hoofdstuk 3). Na bestudering van de beschikbare wetenschappelijke literatuur en het uitvoeren van een set van voorlopige experimenten konden wij concluderen welke van de 236 aminozuren in het PibD-eiwit mogelijk verantwoordelijk waren voor de splitsingsreactie. We vonden negen „kandidaat“-aminozuren in de PibD-eiwitsequentie. Het PibD-gen werd daarna zo veranderd, dat in het gecodeerde eiwit telkens één van deze negen aminozuren door een ander aminozuur (namelijk Alanine) vervangen werd. We hebben een set van deze „mutanten“ gemaakt en getest of deze PibD-varianten nog steeds het flagelline-eiwit konden splitsen. Het bleek dat drie mutanten niet meer in staat waren om het flagelline-eiwit te splitsen. Nader onderzoek naar de aminozuurvolgorde van PibD wees uit dat twee van de drie gevonden aminozuren direct deelnamen aan de splitsing van het signaalpeptide. Deze noemt met katalytische aminozuren (in deze context betekent „katalytische“ hetzelfde als „splitsend“). Men kan deze aminozuren vergelijken met een schaar: hoewel de grip en de vorm van een schaar belangrijk zijn voor zijn functie, is het toch de scherpte die ervoor zorgt dat papier geknipt wordt. Wanneer men de schaar bot maakt („muteert“), dan behoudt de schaar zijn oorspronkelijke vorm, maar kan hij geen papier meer knippen. Tot slot hebben we de structuur van het PibD-eiwit in de celmembraan bepaald. Hiervoor hebben we het PibD-gen weer veranderd; in dit geval hebben we het PibD-gen zodanig veranderd dat bepaalde aminozuren door het aminozuur Cysteïne vervangen werden. Cysteïne is een van de 20 aminozuren die in eiwitten voorkomen. Het heeft de bijzondere eigenschap dat het specifiek met bepaalde chemische stoffen gemarkeerd kan worden. Zo’n gemarkeerde cysteïne kan experimenteel aangetoond worden, en hiermee konden wij vaststellen of bepaalde delen van PibD zich aan de binnenkant of aan de buitenkant van het membraan bevonden. Het resultaat van deze studie was dat het PibD-eiwit waarschijnlijk zesmaal door het membraan heengaat (Figuur 1). De delen die in het membraan ingebed zijn noemt men „transmembraansegmenten“. Het begin en het einde van de aminozuurketen van PibD liggen aan de buitenkant van het membraan. Het moet benadrukt worden dat de driedimensionale structuur van PibD veel complexer is. In hoofdstuk 4 wordt het flagelline-eiwit nader bechreven dat door PibD gesplitst wordt. Wanneer men Sulfolobus-cellen bekijkt met behulp van een electronenmicroscoop die in staat is zeer fijne details van deze organismen zichtbaar te maken, dan ziet men touwachtige structuren die aan de cellen vastzitten. Deze structuren worden flagellen genoemd en ze bestaan uit flagelline-eiwitten. In de genoomsequentie van Sulfolobus solfataricus vonden wij naast het flagelline-eiwit-gen nog andere genen, die waarschijnlijk een rol spelen bij het samenstellen van flagelline-eiwitten. Eén van deze genen werd gericht uitgeschakeld (geïnactiveerd). Cellen waarin dit gedaan was beschikten niet meer over flagellen en konden dus ook niet meer zwemmen. Daaruit kunnen wij concluderen dat het geïnactiveerde gen direct of indirect betrokken is bij het samenstellen van flagellen. Een andere conclusie is dat de touwachtige flagelstructuren inderdaad voor de voortbeweging van de cellen verantwoordelijk zijn. In het kader van dit project werden ook flagellen van cellen verwijderd en onder de electronenmicroscoop bekeken. Met een speciale computertechniek was het mogelijk om uit een groot aantal beelden, een enkel beeld van hoge kwaliteit te produceren (afbeelding in Box 1, door het vergrootglas). Hoofdstuk 5 ten slotte beschrijft een interdisciplinaire studie (verschillende takken van wetenschap werkten samen) met als doel, tot nu toe onbekende genen te vinden die coderen voor eiwitten met klasse III signaalpeptiden. In een samenwerkingsverband met twee onderzoeksgroepen in de VS werd een computerprogramma ontwikkeld dat in genoomsequenties kan zoeken naar zulke genen. Ten tijde van de studie hadden wij naast die van Sulfolobus solfataricus nog 21 andere complete genoomsequenties van archaea tot onze beschikking, Hierin vonden wij meer dan 300 genen die aan de door ons gestelde criteria voldeden. We hebben twee genen van het archeon Methanococcus maripaludis uitgezocht om onze voorspelling experimenteel te testen. Met een vergelijkbare strategie als die in hoofdstuk 2 wordt beschreven, konden wij aantonen dat een van de signaalpeptidasen van Methanococcus maripaludis het „nieuwe“ eiwit met klasse III signaalpeptiden inderdaad splitst. De precieze functie van dit nieuwe eiwit kan in de toekomst nader onderzocht worden. In de algemene inleiding (hoofdstuk 1) wordt onze huidige kennis besproken hoe eiwitten van archaea door het membraan naar buiten gebracht worden en welke (membraan)eiwitten voor dit proces verantwoordelijk zijn. Verder worden in dit stuk bekende „celaanhangsels“ van archaea, zoals bijvoorbeeld flagellen, besproken. In hoofdstuk 6 tot slot worden de resultaten van het gehele onderzoek nog een keer samengevat en bediscussieerd. Het hoofdstuk eindigt met ideeën voor toekomstige onderzoeksmogelijkheden op dit gebied.