Anaplerotische Reaktionen in $\textit{Corynebacterium glutamicum}$ : Untersuchungen zur Bedeutung der PEP-Carboxylase und der Pyruvat-Carboxylase im Zentralstoffwechsel und bei der Aminosäure-Produktion

Abstract

Anaplerotische Reaktionen dienen dazu, während des Wachstums und der Aminosäure-Produktion den Tricarbonsäure-Zyklus kontinuierlich mit Oxalacetat aufzufüllen. Diese Funktion wird bei Wachstum auf Kohlenhydraten durch Carboxylierung von PEP oder Pyruvat zu Oxalacetat übernommen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung anaplerotischer C$_{3}$-carboxylierender Enzyme in $\textit{C. glutamicum}$ und die Aufklärung der Rolle dieser Enzyme für das Wachstum und die Aminosäure-Produktion. 1. Eine definierte PEP-Carboxylase-negative Mutante von $\textit{C. glutamicum}$ zeigte auf Minimalmedium mit Glucose das gleiche Wachstum wie der Wildtyp, und eine entsprechende Mutante des Lysin-Produktionsstamms MH20-22B produzierte gleich viel Lysin wie der Ausgangsstamm. Das Ergebnis zeigt, daß die PEP-Carboxylase für das Wachstum und die Aminosäure-Produktion von $\textit{C. glutamicum}$ nicht essentiell ist. Damit war nachgewiesen, daß $\textit{C. glutamicum}$ über eine weitere anaplerotische Sequenz verfügt, die die PEP-Carboxylase ersetzen kann. 2. Durch die physiologische Charakterisierung definierter PEP-Carboxylase- / Isocitrat-Lyase-Doppelmutanten konnte der Glyoxylat-Zyklus als alternative anaplerotische Sequenz bei Wachstum auf Glucose oder Lactat ausgeschlossen werden. H$^{13}$CO$_{3}^{-}$-Markierungsexperimente ergaben, daß die PEP-Carboxylase-negative Mutante wie der Wildtyp eine Carboxylierung von PEP oder Pyruvat katalysiert. Das zeigt, daß das zur PEP-Carboxylase alternative Enzym eine C$_{3}$-Carboxylierung katalysiert. 3. In $\textit{C. glutamicum}$ konnte eine IDP/GDP-abhängige PEP-Carboxykinase nachgewiesen werden, die $\textit{in vitro}$ sowohl die Carboxylierung von PEP zu Oxalacetat mit einer spezifischen Aktivität von ca. 80 mU/mg Protein als auch die Decarboxylierung von Oxalacetat zu PEP mit einer spezifischen Aktivität von ca. 1 U/mg Protein katalysiert. Die 10-fach niedrigere carboxylierende Aktivität und die Hemmung der PEP-Carboxykinase in der anaplerotischen Richtung durch ATP und ADP deuten an, daß die PEP-Carboxykinase $\textit{in vivo}$ eine gluconeogenetische Funktion hat. Neben der PEP-Carboxykinase konnten in $\textit{C. glutamicum}$ auch das Malat-Enzym und die Oxalacetat-Decarboxylase nachgewiesen und als anaplerotisch aktive Enzyme ausgeschlossen werden. 4. In permeabilisierten Zellen von $\textit{C. glutamicum}$ konnte die Pyruvat-Carboxylase mit spezifischen Aktivitäten von ca. 15 mU/mg TG bei Wachstum auf Glucose und ca. 50 mU/mg TG bei Wachstum auf Lactat nachgewiesen werden. Das Enzym wird sowohl durch ADP (K$_{i}$ = 2,6 mM) und AMP (K$_{i}$ = 0,76 mM) als auch durch Acetyl-CoA (K$_{i}$ = 0,11 mM) inhibiert. Mit der Pyruvat-Carboxylase verfügt $\textit{C. glutamicum}$ über ein zur PEP-Carboxylase alternatives anaplerotisches Enzym. [...