Gli aromi a funzione tiolica svolgono una funzione importante nella determinazione delle caratteristiche sensoriali di alcuni vini. In particolare, il 3-mercaptoesanolo, l\u2019acetato di 3-mercaptoesile ed il 4-mercapto-4-metilpentan-2-one, identificati inizialmente in vini derivanti da uve Sauvignon blanc, sono stati riscontrati anche in altre variet\ue0 suggerendo che essi possano contribuire all\u2019aroma di diversi vini. L\u2019elevato impatto olfattivo di tali molecole ne spiega l\u2019importanza nonostante esse siano presenti nei vini a concentrazioni estremamente basse (ng/L). Quest\u2019ultima caratteristica rappresenta la difficolt\ue0 maggiore alla loro identificazione e quantificazione.
I tioli varietali sono presenti in mosti e uve come precursori non volatili. In particolare, coniugati del glutatione e della cisteina sono stati identificati come precursori. Nel corso del processo di vinificazione, l\u2019attivit\ue0 del lievito \ue8 alla base della liberazione di questi aromi. Le pratiche enologiche possono influenzare il contenuto in tali precursori nei mosti anche se non \ue8 stata identificata una diretta correlazione tra contenuto in precursori nei mosti e tioli liberi nei vini, suggerendo che vie sintetiche alternative ed interazioni pi\uf9 complesse siano responsabili della presenza di tali aromi nei vini.
Gli scopi della ricerca sono stati la valutazione di nuovi approcci analitici volti ad evidenziare la presenza di aromi a funzione tiolica nei vini, indagini riguardanti possibili vie biosintetiche alternative e l\u2019effetto del ceppo di lievito sul contenuto in molecole responsabili della stabilit\ue0 degli aromi tiolici nei vini.
L\u2019impiego di composti mercurati \ue8 il metodo pi\uf9 efficace ad oggi in uso per l\u2019analisi dei tioli volatili. L\u2019utilizzo di tali molecole rappresenta tuttavia un rischio per la salute e la sicurezza, inoltre le metodiche proposte sono estremamente complesse. Nuovi approcci analitici sono quindi stati valutati al fine di individuare una metodica pi\uf9 semplice e sicura.
Nel corso di approcci gas cromatografici la reattivit\ue0 del gruppo tiolico verso addizioni nucleofile \ue8 stata utilizzata per la formazione di derivatizzati.
Alcuni autori hanno proposto la derivatizzazione mediante pentafluorobenzil bromuro, solitamente correlata ad acquisizioni spettrometriche con ionizzazione chimica e selezione di ioni negativi. Si ottiene pertanto sensibilit\ue0 favrita da una minor frammentazione delle molecole ed una maggior selettivit\ue0 per elettrofili, qual \ue8 il fluoro. Tuttavia queste tecniche sono poco diffuse. Si \ue8 pertanto testata la possibilit\ue0 di utilizzare la ionizzazione ad impatto elettronico e selezione degli ioni positivi (pi\uf9 diffusa nei laboratori di ricerca enologica). La tecnica messa a punto ha permesso di individuare ioni caratteristici, nonostante una maggior frammentazione. La reazione di derivatizzazione \ue8 stata possibile in diversi solventi organici.
La formazione dei prodotti di derivatizzazione \ue8 possibile in ambiente acquoso dal quale possono esser estratti selettivamente utilizzando diverse fasi stazionarie, grazie alle loro caratteristiche di idrofobicit\ue0, anche se l\u2019ambiente fortemente basico determina l\u2019idrolisi di gruppi esteri.
L\u2019estrazione di tioli aromatici da soluzioni acquose mediante fasi solide \ue8 possibile. Ciononostante, la derivatizzazione applicata a molecole tioliche trattenute in fase solida od eluite mediante solvente organico non ha permesso l\u2019identificazione di aromi a funzione tiolica ad un livello sufficiente di sensibilit\ue0.
Si \ue8 pertanto studiato l\u2019impiego di un estere alchinico come derivatizzante capace di addizione ai gruppi tiolici. Il prodotto di addizione tra etil propiolato e tioli volatili pu\uf2 essere identificato mediante tecniche di spettrometria di massa. La reazione, che avviene in ambiente acquoso, \ue8 favorita da condizioni basiche non cos\uec drastiche da condurre all\u2019drolisi di gruppi esteri. Il prodotto ottenuto da tale addizione nucleofila pu\uf2 esser selettivamente estratto da soluzioni acquose. Una metodica analitica innovativa basata su tale reazione ha dunque permesso l\u2019identificazione di tioli aromatici in vino a concentrazioni prossime alla loro soglia di percezione.
La quantificazione di aromi tiolici in vino anche mediante metodiche di cromatografia liquida \ue8 possibile grazie all\u2019impiego di derivatizzanti con caratteristiche fluorescenti. L\u2019individuazione delle condizioni ottimali di derivatizzazione e di composti responsabili della perdita di tioli volatili hanno giocato un ruolo chiave nel successo di tale approccio analitico.
L\u2019interazione tra ione bisolfito ed esenale \ue8 stata indagata nel corso della valutazione di vie biosintetiche alternative responsabili della presenza di 3-mercaptoesan-1-olo (3-MH) nei vini.
La formazione di sulfonati stabili \ue8 strettamente correlata a specie la cui struttura \ue8 simile al 3-MH. Tali reazioni avvengono in ambiente acido, suggerendo un simile meccanismo anche nei mosti. La prima addizione dello ione bisolfito \ue8 al gruppo carbonilico dell\u2019aldeide insatura. Ciononostante il prodotto pi\uf9 stabile \ue8 rappresentato da un disulfonato che si \ue8 rivelato non essere un precursore dell\u2019aroma tiolico. La formazione di tale sulfonato \ue8 correlata ad un monosulfonato di struttura simile al 3-mercaptoesan-1-olo. La sintesi della specie pura permetter\ue0 di valutare se possa esserne considerato un precursore.
L\u2019addizione nucleofila di tioli a chinoni \ue8 la maggior responsabile della perdita di tali aromi nei vini. La presenza di composti che riducano tali chinoni \ue8 strettamente correlata alla stabilit\ue0 degli aromi tiolici. Il glutatione, naturalmente presente nelle uve e nei vini, \ue8 in grado di svolgere tale funzione. Il contenuto di GSH nei vini \ue8 influenzato dalle operazioni di vinificazione. In particolare, sono stati testati diversi ceppi di lievito nel corso della fermentazione alcolica e si \ue8 verificato che la scelta del ceppo di lievito pu\uf2 influenzare il contenuto in tale tripeptide. Inoltre nel corso della fase sur lies non \ue8 stato riscontrata una variazione del contenuto totale di glutatione, ascrivendo il rilascio del tripeptide alle fasi di attivit\ue0 metabolica.Thiol related aromas play a key role in sensory profile of certain wines. In particular, 3-mercaptohexan-1-ol, 3-mercaptohexyl acetate and 4-mercapto-4-methypentan-2-one were firstly identified in Sauvignon blanc wines. Same molecules were then evaluated to contribute to several wine made from different grape varieties. The strong smelling properties of volatile thiols explain their importance, even if such molecules are present at extremely low concentration in wine (ng/L). This characteristic represents the main issue in their identification and quantification in wine.
Aromatic thiols are present in grape and juice as non-volatile compounds. In particular, glutathione and cysteine conjugates were identified to be precursors of such smelling molecules. During vinification process, yeast activity is responsible for their release from the cysteinilated precursors. The amount of thiol precursor in juice is influenced by oenological practices. Despite this, no direct correlation between the level of precursors in juice and concentration of thiol in wine has been observed, thus suggesting that alternative biogenetic pathway and/or more complex interaction are responsible for occurrence of aromatic thiol in wine.
The aims of this PhD were to evaluate new analytical approaches aimed to evaluate the occurrence of volatile thiols in wine, to study alternative biogenetic pathway leading to thiol realted aroma and to assess yeast strain effect on the amount in molecules responsible for thiol stability in wine.
The employmet of organo-mercury compounds represents the most effective method for thiol quantification in wine. The use of mercury constitutes hazard for health and environmental safety. Furthermore, such methods are extremely time-consuming. New analytical approaches were evaluated with the aim to develop an easy-to-apply method.
In gas chromatographic approaches, thiol group reactivity towards nucleophilic addition was used to make derivatised product.
Pentafluorobenzyl bromide has been reported by several authors. This derivatising agent has been employed by means of negative ions chemical ionization mass spectrometry. Chemical ionization is responsible for low fragmentation and shares with the electron capture detection a selective and sensitive response to electrophilic atoms (halogens), as fluorine is. Despite this, such techniques are not widespread. In this study electron impact ionization in positive mode mass spectrometry was then evaluated. The developed method allowed to identify characteristic fragments even if high amount of fragmentation was present. Derivatisation reaction was possible in different organic solvents.
Derivatisation of aromatic thiol can be carried out in aqueous media too. Thanks to their hydrophobicity, reaction products can be extracted by means of different sorbents. Despite this, the presence of alkali is required, thus leading to the hydrolysis of esters.
Solid phase extraction of volatile thiol from aqueous media is possible. Despite this, in-sorbent derivatization process, as well as derivatisation of volatile thiol in organic solvent, did not allow to quantify thiol related aroma at concentration close to their perception threshold.
The employment of an unsaturated alkene as derivatising agent was then studied. The key feature of ethyl propiolate employment in volatile thiols derivatization, is the thiol nucleophilic addition to ynonates. The derivatised product can be identified by MS technique. The reaction take place in aqueous media. Neutral or mild basic conditions are required to carry out the derivatization procedure, where no ester hydrolysis was showed. The employment of this new derivatising agent allowed the assessment of volatile thiols in wine at concentration close to their perception threshold.
Thanks to the employment of fluorescent derivatising agent, quantification of volatile thiol in wine was demonstrated to be possible by means of liquid chromatographic approaches too. The key feature in this analytical approach was the optimization of derivatisation reaction and the individuation of chemical compounds responsible for volatile thiol loss.
Interaction between trans-2-hexenal and bisulfte was studied in order to evaluate alternative biogenetic pathways leading to 3-mercaptohexan-1-ol (3-MH) in wine. Biogeneic pathway of stable sulfonates is stricktly related to species whose structure is similar to 3-MH. The addition occours in aqueous acidic media, thus suggesting similar pathway in grape juice. The initial addition of bisulfite to the unsaturated aldehyde is at the aldehydic function. Despite this, the most stable product is a disulfonate which was demonstrated it is not a putative precursor of volatile thiol in wine. The formation of such stable product is correlated to a mono-sulfonate whose structure is similar to 3-mercaptohexan-1-ol. Pure species synthesis will allow to evaluate if this compound can be regarded as a precursor of the volatile thiol in wine.
Thiol nucleophilic addition to quinones is the major responsible for thiol related aroma loss in wine. The presence of compounds able to reduce such quinone is strictly correlated to thiol stability in wine. The tripeptide glutathione, naturally occurring in grape and wine, is responsible for this protective effect. Wine making technique can affect GSH content in wine. In particular, several yeast strains were tested during laboratory-scale alcoholic fermentation. As a result, yeast strain was evaluated to influence GSH content. Moreover, during aging on lees total glutathione content did not vary, thus production and liberation of this tripeptide is related to living cells
