Etablierung einer Methodik zur Differenzierung glatter Muskelzellen

Abstract

Ziel meiner Diplomarbeit war es, die Differenzierung von porcinen (PASMC) und humanen (HUVSMC) glatten Muskelzellen (smooth muscle cells; SMC) zu modulieren. Die Funktionen glatter Muskelzellen in vivo spiegeln sich in einer Reihe von unterschiedlichen Phänotypen, welche vom kontraktilen (S-SMC) bis zum synthetischen Typ (R-SMC) reichen, wider. Studien zeigen, dass glatte Muskelzellen durch die Kultivierung ihre kontraktilen Fähigkeiten verlieren und ihren Phänotyp in einen synthetisch, proliferativen ändern. Es gibt jedoch eine Reihe von Faktoren, welche die Ausprägung des Phänotyps beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Kultivierung der SMC unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Als Kontrolle wurde die Inkubation mit DMEM, dem 10 % Kälberserum (FCS) zugesetzt wurde, definiert. Weiters wurde der Zusatz von 200 g/ml Heparin, und/oder die Reduktion der FCS Konzentration auf 1 % getestet. Durch Wahl der unterschiedlichen Kulturbedingungen wurde versucht, eine Methode zu etablieren, welche die Differenzierung der SMC in Richtung des kontraktilen Phänotyps verschiebt. Um den Differenzierungsstatus zu charakterisieren, wurden durch Western Blot und qPCR-Experimente die Expression etablierter Differenzierungsmarker (-Actin, MYH11, Calmodulin, Smoothelin, Desmin) untersucht. Unter Heparinzusatz konnte eine Erhöhung der Expression von -Actin (PASMC) und Desmin (HUVSMC) beobachtet werden. Auf die Expression der anderen Differenzierungsmarker hatten die unterschiedlichen Kulturbedingungen keinen Effekt. Weiters war es das Ziel der Diplomarbeit, die Agonisten-induzierte intrazelluläre Ca2+-Konzentration mittels Fura-2-AM Fluoreszenz zu messen. Durch stark unterschiedliche Zellzahlen innerhalb der verschiedenen Kulturbedingungen war der Vergleich jedoch nicht möglich. Unter Kontrollbedingungen konnten jedoch für beide Zelltypen Effekte von ATP, Angiotensin II und Bradykinin gemessen werden.The aim of my diploma thesis was to modulate the differentiation of porcine (PASMC) and human (HUVSMC) smooth muscle cells (SMC). In vivo, different phenotypes of SMC, ranging from contractile (S-SMC) to synthethic types (R-SMC), are described to be responsible for distinct physiological functions. However, it is well established that during the cultivation process, SMC often lose their contractile abilities by changing the phenotype into a synthethical, proliferative one. There are a number of factors that are known to affect the expression of the phenotype. In this study, SMC were cultivated under four different conditions. Control incubations were performed in DMEM containing 10% fetal calf serum (FCS) as additive. Moreover, the effect of 200 g / ml heparin and/or the reduction of FCS to 1% were tested. Applying these different culture conditions, we tried to establish a method that shifts the differentiation of SMC to the contractile phenotype. To characterize the differentiation status, a series of well-known differentiation markers (-actin, MYH11, calmodulin, smoothelin, desmin) were analyzed by Western blot and qPCR. Addition of heparin induced an increase in the expression of -actin (PASMC) and desmin (HUVSMC). Expression of other differentiation markers were not affected. Another aim of this study was to analyze the agonist-induced intracellular Ca2+ concentration of SMC by the use of Fura-2-AM fluorescence. Experiments were hampered by considerably differing cell numbers withing the different culture conditions. However, for control conditions, effects of ATP, angiotensin II, and bradykinin were reproducibly measured for both cell types.vorgelegt von Sarah LadenhaufZusammenfassungen in Deutsch und EnglischAbweichender Titel laut Übersetzung des Verfassers/der VerfasserinKarl-Franzens-Universität Graz, Diplomarbeit, 2018(VLID)282749