Método simple para la detección múltiple de viroides de cítricos

Abstract

La deteccion de viroides mediante RT-PCR en Mexico es de uso comun en los laboratorios de acreditacion para determinar la calidad sanitaria de plantas de citricos, cuando se van a utilizar arboles madre para propagar plantas de vivero. En el presente trabajo se describe una metodologia simple para la deteccion multiple de los viroides Citrus exocortis viroid (CEVd), CVd II, y Citrus viroid III (CVd III) en una sola reaccion de RT-PCR. La extraccion de acidos nucleicos se efectuo con cantidades minimas (250 mg) de tejido, y adicionando 1% polivinilpirrolidona en la solucion salina de extraccion de glicina-fosfato. La deteccion de los tres viroides fue exitosa cuando las reacciones de RT se efectuaron con 2.0 ¿Êg de ARN, 1.0-1.5 mM de dNTP¿fs, 0.90 ¿ÊM, del iniciador complementario (C) para CEVd, y 0.49 ¿ÊM para los correspondientes iniciadores C para CVd II y CVd III, respectivamente, seguidas por reacciones de PCR con 2-4 ¿ÊL de cADN procedente de RT y 10, 5, 5 pmoles del juego de iniciadores homologos (H) y C para CEVd, CVd II y CVd III. Al usar menos de 1.0 ¿ÊM de dNTP¿fs, asi como cantidades iguales de los iniciadores C en las reacciones de RT y cantidades iguales del juego de iniciadores C y H para CEVd and CVd II y CVd III en las reacciones de PCR, proporcionaron deteccion simultanea confiable para CVd II y CVd III, pero resultados erraticos con CEVd