The impact of Rab5 on the formation of glial cytoplasmic inclusion : implications for multiple system atrophy

Abstract

Multisystematrophie (MSA) wird als eine fortschreitende neurodegenerative Krankheit definiert, die geprägt ist durch sogenannte oligodendrogliale, zytoplasmatische Einschlüsse (GCIs). Das neuronale Protein -Synuklein (AS) gilt als eines der Hauptbestandteile von GCIs. Bis heute sind die exakten Mechanismen, welche an der Bildung von AS-positiven intrazycoplasmatischen Einschlüssen beteiligt sind nicht endgültig bekannt. Eine Hochregulierung des endozytotischen Proteins Rab5 in MSA Gehirnen wurde nachgewiesen. Diese Erhöhung des Proteins Rab5 könnte zu einer erhöhten endozytotischen Aktivität führen welche wiederum an der Bildung von intrazytoplasmatischen Einschlüssen beteiligt sein könnte. Das Ziel dieser Masterarbeit war es, die Aufnahme verschiedener AS Formen, sowie die Bildung von intrazytoplasmatischen Einschlüssen in Rab5 überexprimierenden Oligodendrozyten zu untersuchen. Die Zellen wurden genetische modifiziert um eine erhöhte Rab5 Expression zu erreichen und folglich mit verschiedenen extrazellulär zugegebenen AS Formen inkubiert. Die Aufnahme und die Ansammlung des rekombinanten löslichen und fibrillären AS (sAS, fAS) wurde mittels Immunzytochemie sowie der Western Blot-Methode (WB) ausgewertet. Beide Methoden bestätigten in Rab5 transfizierten Oligodendrozyten eine erhöhte Menge an Rab5 Protein im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen. In Oligodendrozyten welche für 24 Stunden mit AS inkubierten worden waren, konnte aufgenommenes AS im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Größe der AS Einschlüsse zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen Rab5 überexprimierenden Zellen und Kontrollzellen welche kein Rab5 überexprimierten. Die Rab5 Überexpression war gekoppelt mit signifikant erhöhten LC3B Werten, wohingegen Oligodenrozyten, welche mit extrazellulären sAS oder fAS inkubiert worden waren eine Herabregulierung des Autophagie Markers LC3B in transfizierten und nicht transfizierten Zellen aufwiesen. Die Daten lassen vermuten, dass eine Rab5 Überexpression in Oligodendrozyten nicht zu einer erhöhten AS Aufnahme führt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass eine Hochregulierung von Rab5 zu erhöhten Autophagie Werten führte, welche allerdings durch die Zugabe bzw. Aufnahme von extrazellulärem AS gesenkt wurden.Multiple system atrophy (MSA) is a progressive neurodegenerative disease characterized by oligodendroglial cytoplasmic inclusions (GCIs). The mainly neuronal protein -synuclein (AS) has been distinguished as the main component of GCIs. Yet, exact mechanisms involved in the formation of the AS-positive intracytoplasmic inclusions have not been described to this date. An upregulation of the endocytotic protein Rab5 has been described in MSA brains leading to the assumption that enhanced endocytosis might be involved in the formation of these inclusions. The objective of this Master thesis was to investigate the internalization and inclusion formation of different AS forms in oligodendroglial cells overexpressing Rab5. Oligodendroglial cells were genetically modified to overexpress Rab5 and then exposed to different forms of extracellular AS. The uptake and accumulation of recombinant soluble and fibrillized AS (sAS, fAS) was examined using immunocytochemistry and western blot (WB) analyses. WB analysis and immunofluorescence confirmed increased Rab5 levels in Rab5 transfected oligodendroglia compared to non-transfected oligodendrocytes. Exposure of oligodendroglial cells to AS for 24 hours resulted in AS internalization in the cytoplasm. The size of AS inclusions showed no significant difference in cells overexpressing Rab5 compared to non-transfected controls. Rab5 overexpression was linked to significantly increased LC3B levels, whereas oligodendrocytes incubated with extracellular sAS and fAS, induced autophagy downregulation in Rab5 transfected and non-transfected cells. These data suggest that Rab5 overexpression in oligodendroglial cells does not trigger an enhanced internalization of AS. Rab5 upregulation leads to increased autophagy levels, which however get reduced by adding extracellular AS.by Dominik BrückZusammenfassung in englischer und deutscher SpracheUniversität Innsbruck, Masterarbeit, 2015(VLID)85320