Serikawa, Tadao

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Progress on Laboratory Rat Research

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44 招待 構潰 要旨実験用ラット研究の進展Progress on Laboratory Rat Research 芹川| 忠夫Tadao Serikawa 京都大学大学院医学研究科附属動物実験施設Institute of Laboratory Animals， Graduate School of Medicine， Kyoto University Summary Albino and h∞ded (or piebald) rats are one of the most frequently used laboratory animals for the past 150 ye町 s.Our current study showed that al existing albino laboratory rats have only one single ancestor and its albino mutation had originaly悶 urredin hooded rats. Recent progressing technologies for genetically engineered rats; ENU mutagenesis， zinc-finger nucleases (ZFNs)， transcription activatorlike effecω'r nucle細田(TALENs)，and rat ES cells， can provide useful rat models for functional genomi伺 andhuman必.seases.Genetically engineered rats developed using these technologies are deposited inωNBRP-Rat and supplied to interested researchers. AlI NBRP-Rat related information is a∞essible at www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/nbr. はじめに岡山実験動物研究会が 30周年を迎えられたこと、心からお祝い申し上げます。昭和 47年 1月に発行された「畜産の研究」第 26巻第 1号に、畜産と環境というテーマの特集欄があり、岡山実験動物研究会の初代会長である猪貴義先生が「実験用動物における遺伝制御、病気制御、環境制御、環境制御の必要性」と題して実験動物のあり方を紹介されている。これを獣医学部の学生時代に読み、実験動物の世界に欝われた。約 1年半後に京都大学に赴任して、上司の山田淳三先生を介して猪先生とお会いすることができた。山田先生が関西実験動物研究会の初代会長であり私が現会長であることからも、岡山実験動物研究会には特別な想いがある。実験用しろねずみの起漕さて、実験用ラット研究の進展について述べる前に、昔、「しろねずみJと表現されていたアルビノラットに関して、私たちが得た最近の知見を紹介したい。実験用のアルビノラットの代表格は米国のフィラデルフィアにあるウイスター研究所から世界中に広まったウイスターラットであり、現存する多くのラット系統がこのラットに由来することが知られている(1 ) 0 1906年に、 シカゴ大学からフィラデルフイアにあるウイスター研究所にアルビノラットを持ち込んだとされている第 3代所長のドナルドソンは、当時、実験に用いられていたノルウエーラット(和名ドブネズミ， Rattus norvegic凶) について、1)野生ラットと家畜化されたラットが容易に手に入ること、 2)後者は主にアルビノラットと斑紋のあるラット (piedratあるいはhooded(頭巾斑)rat)であること、そして、 3)アルビノラットの起源が単ーなのか複数なのか、 ヨーロッパのコロニーに直接関係があるのかどうか不明であることを自身の著書に記している (2)。また、ドナルドソンと共にシカゴ大学からウイスター研究所に移って活躍した畑井新喜司は、実験用しろねずみをドブネズミの変異種Mus norvegicus var. albus HATAI と命名すると共に、新たなアルビノ変異種を飼育繁殖しているラットから得られたことを報告している (3)。後で述べるNBRP-Ratに寄託されているアルビノラットと所在が明らかなアルビノラット、合計 117系統の DNAを調べたところ、すべての系統が共通のチロシナーゼ遺伝子の変異を持っていることが判った。そして、頭巾斑形質を決定する hooded遺伝子座は Kit遺伝子の存在領域にあり、驚いたことに、アルビノ系統と頭巾斑の系統のすべてが全く同じ Kit遺伝子変異を持っていた。これらの事実から、アルビノ変異は複数の種類が存在するのではなく、唯一の変異型が現存していること、しかも、そのアルビノ変異は頭巾斑のラットに生じた可能性が極めて高いと推定された。要するに、実験用アルビノラットは一頭の頭巾斑ラットに由来している可能性を示す証拠が得られたのである (4)。もし、その頭巾斑ラットやアルビノラットが、江戸時代の「養鼠玉のかけはしJ(5)や「珍翫鼠育州J(6)に紹介されている愛玩用ラットそのものであれば、大変楽しい話である。しかし、江戸時代の愛玩用ラットに由来することが明らかなラット系統が知られていないので、その点は未だ不明なままである。新しい按術による疾患モデルラットの開発実験用ラットは医学生物学等における多様な基礎研究や医薬品等の開発研究あるいは安全性試験に活用されている。また、選抜育種法によって、高血圧、糖尿病、てんかん等の多くの有用な疾患モデルラットが開発されており、それらを利用したヒト疾患の45 発症機構、予防法、治療法についての研究が行われてきた。ラットはマウスと共に遺伝要因と環境要因を厳格に統御した実験を行うことができる。また、多産で繁殖性が良い。そして、ラットはその適当な大きさに起因する生体試料の採取や外科的手術の容易性もあることから、様々な実験に適応性がある。マウスに比べて学習能が高いこともあり、ヒト疾患モデルとしての応用性が極めて高い。加えて、マウスとラットは異なる種であり、両種によって得られる実験成績は遺伝子の機能のより深い理解や動物からヒトへゆ‘外そう'をより確かにすることができる。このようにして、マウスとラットは、モデル動物としての補完性と深さを与えている。最近、新たな革新的技術により遺伝子改変ラットの作製が可能となってきたことから、ラット研究に対する期待が大いに高まっている。実際、 2010年のネイチャー誌の 9月9日号には、 “ラット時代に入る" という表題の記事が掲載された (7)。そこには、幹細胞技術における進歩は、マウス以外の晴乳動物におけるジーンターゲティングの障壁を取り壊し世。多様な研究の機会が特に実験用ラットに関して今開かれていると述べられている。そして、サイエνス誌の同年度のBreakthroughof the Yearの一つに“ラットの復古"が同様の評価で選ばれた (8)。これらは、ラットにおいても ES細胞が複数の研究機関で開発され、それらを利用して遺伝子ノックアウトラットを作製できることが示され、さらに、標的遺伝子の二重鎖切断を可能とする人工ヌクレアーゼの一種、ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)を用いる新たな技術によって遺伝子ノックアウトラットが作製できるようになったことを反映したものである.我々の研究グループでは、I12rg遺伝子を標的にしたZFNのmRNAを受精初期匹の雄核にマイクロインジェタションクションするという過程を経て、 X-SCIDラvト(X連鎖重症複合免疫不全症のモデル)を作製した (9)。続いて、同様の手法でPrkdc遺伝子をノッタアウトした SCIDラットを開発した (10)。この技術の優れたところは、いずれのラット系統においても標的遺伝子ノックアウトを作製することが可能なこと、複数の標的遺伝子を同時にノックアウトすることが可能であることである。私たちの場合には、F344ラットを用いて、 I12rg遺伝子と Prkdc遺伝子のダブルノックアウトラットの作製に成功している(10)。そして、重度免疫不全の形質をもっこれらのラγトがヒト化ラットとして利用できるかどうか検討されている。また、この技術を用いた相同遺伝子組み換えや、新たな人工ヌクレアーゼ TAL(ttanscription acti vator-like)エフェクターヌクレ'rー ゼ TALENの利用についても研究が進められている。標的遺伝子変異ラット作製の先行研究として、我々のグループは遺伝子主導の ENUミュータジェネシス法を確立して、 ENUミュータントアーカイプKyoto University Rat Mutant Archive、略してKURMAを作製した。これは、 l個体あたり約千個の点突然変異をもっ雄のF344ラットから採取したDNAと凍結精子の l万頭分のセットである。標的遺伝子変異をスクリーニングする MuT-POWER(Mu Transposition POoling method With sequencER)法と顧微授精法により、ヒト疾患に関わる遺伝子変異と類似の遺伝子変異をもっ新規のモデルラットを作製している(11)。このシステムにより、てんかんのモデルとしては、全般てんかん熱性けいれんプラスというヒト疾患を標的として、Scnla遺伝子変異のミスセンス変異をもっ熱性けいれんモデルラット (12，13， 14， 15)、および常染色体優性側頭葉てんかん (ADLTE)を標的疾患として、 Lgi1遺伝子のミスセンス変異をもっ音誘発性てんかんモデルラット(16)を開発した。他に、家族性大腸がんの原因遺伝子である Apc遺伝子にナンセンス変異をもち、アゾキシメタンとデキストラン硫酸を用いる大腸ガン誘発試験系において、顧著な大腸ガン感受性を示す臥D(Kyoto Apc Delta)ラット (17，18)、LDLレセプターのリガンド結合部位にミスセンス変異をもっ Ldlr変異ラット (19)、あるいはレプチン遺伝子にナンセンス変異をもっ肥満ラットを作製した。さらに、 KURMAの精子を採取するために育成しているラット群の中には、形態学的な異常や行動異常を示すラットが現れてくるので、興味深いミュータント表現型を示すラットにおいては、ポジショナルクローニング法により変異を生じた遺伝子を同定する研究を行った。その結果、Hr遺伝子にナンセンス変異をもち、ライノマウスと同様の皮膚疾患を示す新たなへアレスラット (20)や Kcnalにミスセンス変異をもち筋波動症とてんかんを併発する Episodicataxia typel (EA1)モデルラット(21)を開発することができた。ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラットJの意穣平成 14年 7月に、我が国のナショナルバイオリソースプロジェクト (NBRP)のーっとして、 NBRP-Ratが発足した (22，23)。第l期と第2期の合計 10年間に続き、今年度から第 3期が始まり、優れたラットの収集・保存・提供システムが運用されている。寄託者の権利保護の手続き(提供同意書)を経て収集されたラット系統は、 650系統 (2012年 11月現在)を超え世界最大のラットリソースとなっている。生体保存に加えて、順次、脹および精子による保存、パックアップ保存がなされており (24)、フリーズドライした精子を長期間冷蔵保存した後に顕微授精で個体復帰できることができることやその輸送における便宜性が示された (25)。主たる系統については、フェノームプロジェクト (26)と称して、同一条件下で、血液、尿、臓器重量、体重、行動、血圧などの検査を実施して、ユーザーフレンドリーなデータベースとして公開している。 そして、各パラメータの系統ランキングデータを参考にして最適なラット系統を選択できる。遺伝多型マーカーの系統プロファイル(27)や遺伝子機能に変化を及ぼす遺伝的多型データ(28)についても調べられ一般公開されているので、研究者にとっては大変便利である。さらに、薬効試験や安全性試験等に用いられている代表的な系統の一つである F344系統や有色系統の代表としてLong-Evans系統に着目して、我が国で開発されたラットのリコンビナント系統の親系統でもあるF344/StmとLE/Stmを取り上げ、 BACクローンライブラリ}の作製、 BACエンド配列の決定、全ゲノムシークエンスを行い、それぞれ、一般に利用できるように整備されている。今後、高い精度があると評価されたF344/Stmのゲノムシークエンスデータは、実験用ラットの標準シークエンスとして扱われることになると思われる。NBRP-Rat Home page， ht旬:/lwww.anim.med.kyo旬・u.ac.jp/NBRIおわりに遺伝子改変ラットを作製できる時代が到来したことは、大変すばらしい。欧米のラット研究は活気に溢れている (29，30)。我が国においては、すでに、ラット系統の収集・保存・提供を担う NBRP-Ratという国家的基盤が設立、運用されているとし、う強みがある。それゆえ、遺伝子改変ラットの開発と解析の国家拠点を設立して、我が国の研究者が先導的に行ってきたラットモデルの開発研究や遺伝的基盤研究を継続的に発展させるべきである。そして、生命科学の発展とヒト疾患の克服に寄与して頂きたい。末筆ながら、本講演の機会を与えて頂いた岡山実験動物研究会の関係者に御礼申し上げる。参考文献1. 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