Kimoto, Takafumi

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Pig-a遺伝子を内在性レポーターとして用いる新規な生体内遺伝子変異測定法の開発

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氏 名授 与 した 学 位専攻分野の名称学 位 授 与 番 号学位授与の目付学位授与の要件学位論文の題目木本 崇文博 士工 学博甲第4562号平成24年 3月23日自然科学研究科 機能分子化学専攻(学位規則第5条第 1項該当)DevelopmentofanovelinvivogenemutationassayuslngthePig-ageneasanendogenousreporter(pig-a遺伝子を内在性レポーターとして用いる新規な生体内遺伝子変異測定法の開発)論 文 審 査 委 員 教授 大森葬 教授 今村維克 准教授 金山直樹 教授 酒井裕学位論文内容の要旨Theevaluationofgenemutationsinvivoisusefultofurtherassessthegenotoxicpotentialofchemicalsthatmayberelatedwi也carcinogenicity.Recents山diessuggested血at血eX-linkedphosphatidylinositolglycanclassA(Pig-a)locushadbeenidentifiedasareporterofinvivogenemutationinnowcytometry-basedassaysconductedonperipheralredbloodcels(RBC)orbonemarowerythroid(BME)samplesfromlaboratoryanimals.MutationinPig-acouldabolishGPIsynthesis,which,intum,WouldcauseadeficiencyinGPIanchoredproteinmarkers(e.g.,CD59orCD24)onthecelsurface.ThefunctionofthePig-aproteininthesynthesisofGPIanchorsisconservedinvarietyofeukaryoticcels,includinghumanandrodentcels,whichimpliesthatPig-amutantscanbemeasuredinasimilarmarnerindiferentmammalianspecies.ThusthePig-aassaylSexpectedasapromlSlngtoolforevaluatinglnVivomutagenlCIty･IfocusedonfurtherassessingthefeatureofPig-amutantkineticsandimprovingtheassayprotocolmoreefrlCientlytoincreasethethroughputoftheassay.SeveralflOwcytometricapproacheshavebeendevelopedformeasuringPig-amutant丘equencyuslngratsOrmicetreatedwithtypicalmutagen,N-nitrosoIN-ethylurea.Instudiesconductedwithrats,IdevelopedanOnglnalPig-aassayandmonitoredthekineticsofRBCPig-amutationfrequencylnratstreatedwithENU･OurdataindicatethatENU-inducedPig-amutantRBCsinratspersistforaslongas6monthsafteraslngledoseorthebeginnlngOfsplitdosesofENU,andthatPig-amutantRBCsaccumulateinanear-additivefashion.lnstudiesconductedwithmice,IdevelopedanassayformeasuringPig-agenemutationinBMEandRBCusinganantibodytoglycophorin-associatedproteinTER-119,aspecifccel-surfacemarkerofmurineerythroidlineage.ByconductingbothBMEandRBCPig-aassay,Iprovidedthecrucialevidenceforthemutantmanifestationmodel,whichPig-amutationscausingdeficiencyinGPI-anchoredmarkersarefixedinBM,wherethemutantsproliferate,diferentiateandtransittoRBCFurthermore,IdevelopednovelratPig-aassaysthatfacilitatemeasurlngmutantfrequenciesintwoearlyarisingpopulationsofRBC,BMEsandreticulocytes･IbelievethatthesePig-aassayswilbecomeausefulininvivotoxicologyassayofchemicalsthatmightinduceinvivogenemutation.論文幸査結果の要旨木本氏は医薬品を含む化学物質の発癌性に関連する遺伝毒性を,invivoで効率よく的確に評価する実験系の開発を目指して本研究を行ったoX染色体上に存在するphosphatidylinositolglycanclassA (Pig-a)遺伝子に着目し,この遺伝子をレポーターとして選択することを構想したoPig-a遺伝子が変異して機能を失うとGPIアンカーが合成されなくなるので,細胞表面のGPIアンカータンパク質の発現が低下する｡木本氏は末梢の赤血球 (RBC)や骨髄赤芽球 (BME)上に多く発現するGPIアンカータンパク質であるCD59やCD24の発現を指標として,被験化合物の変異原性を測定する手法を開発した｡pig-a遺伝子の機能はヒトからマウス,ラットに至るまで多くの生物種で保存されているため,この遺伝子をレポーターとして用いることは大きな意味がある.hvivoでの変異原性を評価するために,被験薬物を短期間あるいは長期間授与した動物から血液を少量採取するだけで,血球上のCD59やCD24分子のレベルをフローサイトメトリーにより,短時間で効率よく測定する方法を開発することに成功したOこの方法は例えばN-nitroso-N-ethylureaなどの代表的変異原物質を1回投与したマウスやラットでも,その変異原性を検知できる鋭敏な方法である｡実際にどのような変異が導入されたかについても,木本氏はpig-aの塩基配列解析により,精密な結果を得ている.また,変異原投与の影響がどの程度長期間持続するかについても,興味あるデータが得られている｡この方法は今後,医薬開発の現場などで,実用的な変異原性試験法として広く用いられることが期待される｡以上を勘案して,本論文は博士 (工学)の学位を授与するに値するものと認定する｡

Pig-a遺伝子を内在性レポーターとして用いる新規な生体内遺伝子変異測定法の開発

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