Sato, Takamaro

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Eosinophil Cationic Proteinが正常ヒト線維芽細胞に及ぼす影響に関する研究

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氏 名学 位専門分野の名称学 位 授 与 番 号学位授与の 日付学位授与の要件学 位 論 文 題 目学位論文審査委員佐藤 公麿博士歯学博甲第4521号平成24年3月23日医歯薬学総合研究科病態制御科学専攻(学位規則 (文部省令)第4条第1項該当)EosinophilCationicProteinが正常ヒト線維芽細胞に及ぼす影響に関する研究教 授 大原 直也 教 授 高柴 正悟教 授 仲野 道代学位論文内容の要旨【緒言】EoshophilCationicProtein(ECP)は活性化した好酸球から放出される好酸球特異類粒の一つである｡ECPは.タンパク質自体が有する細胞傷害性や様々な生理活性で好酸球性炎症に関わると考えられている｡一方.近年.マウス線維芽細胞にヒトECPを作用させた研究で.ECPは線維芽細胞に細胞傷害性を持たず,その増殖を冗進させることを示す報告がなされた｡このことは.ECPが好酸球性炎症で線維芽細胞に対し細胞傷害性を持たず,組織の線維化に関与することを示唆する報告である｡しかし.げっ歯類は元来ECPを有さないとみられており.ヒトECPに対する線維芽細胞の応答はマウスとヒトで異なる可能性がある｡ヒトECPが正常ヒト線維芽細胞に及ぼす影響を明らかにすることは.好酸球性炎症の病態を明らかにする上で重要な課題である｡そこで,本研究ではヒトECP刺激が正常ヒト線維芽細胞に及ぼす影響を調べた｡ECP刺激による正常ヒト線維芽細胞の形態変化を観察した｡そして,細胞の形態を司る細胞骨格の変化を filamentous-actin(F-actin)に着目して調べたOさらに.ECP刺激による正常ヒト線維芽細胞の増殖活性そして細胞間情報伝達物質の産生への影響についても調べた｡【材料 ･方法】1.リコンビナントヒトECP(rhECP):既報に従って構築 ･精製したものを.岡山大学大学院自然科学研究科ナノバイオシステム分子設計学の妹尾昌治教授から供与を受けた｡2.細胞とその培養 :ヒト歯肉線維芽細胞 (hum angingivalfibroblasts:HGFs)は,既報に従って健康なヒト歯肉組織から分離 ･培養し.ヒト皮膚線維芽細胞 (humandemal斤broblasts:HDFs)はLonza社から購入した｡培養は.10%ウシ胎児血清 (Fetalbovineserum:FBS)を含むダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM:lnvitrogen)を用い.37oC.5%CO2存在下95% 湿潤下で行った｡なお.5-9継代培養した細胞を実験に供した｡3.ヘマトキシリン･エオジン (HematoxilinEosin:HE)染色 :細胞の形態を,HE染色後に光学顕微鏡下で観察した｡4.免疫蛍光染色法 :F-actinの局在を免疫蛍光染色して蛍光顕微鏡で検出した｡5.ウェスタンブロット法 :細胞総蛋白をsDS-PAGEにて分画し.F-actin量を定量した｡6.細胞数の測定 :細胞の増殖を,細胞数を測定することにより汎定した07.31(4,5-dimethyI-thiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrozoljumbromide(MTT)法 :細胞増殖活性を,MTT法を用いて測定した｡8.抗体アレイ法:細胞間情報伝達物質の産生性を,抗体アレイ法を用いて網羅的に解析した｡9.酵素免疫定量 (enzymellinkedimmunosorbentassay:ELISA)法･.tumornecrosisfactor(TNF)-α.1nterluekin(IL) -6,monocytechemoa肘actantprotein(MCP)-1,MCP-2.regulateduponactivation,normalTexpressedandsecreted(RANTES),eotaxin,fibroblastgrowthfactor(FGF)-2,FGF14.マトリックスメタロプロテア-ゼ (Matrixmetaloproteinase:MMP)11そしてマトリックスメタロプロテアーゼ阻害因子 (tissueinhibitorofmetaloproteinase:TIMP)-1について.ELISA法を用いて定量した｡【結果】正常ヒト線維芽細胞に対してrhECP刺激を行うと.以下の6点を示した｡1.細胞質は進展した2.F-actin量は克進し (p<0.05).その作用はROCK阻害剤であるY-27632により抑制された3,細胞数および細胞増殖活性は有意に克進した (p<0.05)4.細胞間情報伝達物質の産生性は,調べた範囲内では顕著な変化はなかった5.TIMP-1の産生性は有意に克進した (p<0.05)【考蕪】rhECP刺激が.正常ヒト線維芽細胞においてF-actinの豊富な細胞質を進展させ,その作用がROCKの阻害剤であるv27632によって抑制されたことから.ECPのROCKを介した正常ヒト線維芽細胞のアクチン細胞骨格形成克進機構を明らかにした｡また.本研究で明らかにした.ECPが正常ヒト線維芽細胞を増殖させ.細胞増殖活性を克進させる事実は.好酸球性炎症における.組織の線維化を説明する可能性が考えられるO線維化は.MMPとTIMPのバランスが破綻した際.組織においてECMが蓄積することで起こると考えられている｡ECP刺激で正常ヒト線維芽細胞が産生する細胞間伝達物質について抗体アレイ法で調べた結果からは.細胞間情報伝達物質の産生性に顕著な変化を兄いだせなかった｡ しかし.より鋭敏に定量が可能な ELISA法を用いて炎症性サイトカイン.ケモカイン.増殖因子そして ECM の産生 ･分解を制御する因子に着目し調べたところ.ECPは線維芽細胞のMMP-1産生に変化を及ぼさない一方,TIMP-1の産生を有意に克進させていた｡これらの結果から,ECPは正常ヒト線維芽細胞のTIMP-1の産生を克進させることでMMP-1の ECM分解を抑制し.組織の線維化に寄与していることが示唆された｡本研究において,ECPにより形成克進されるストレスファイバーは.Rho-ROCK経路においてインテグリンとの結合に重要な役割を果たすラミニンやフィブロネクチンなどのECMと結合することで.細胞の分化.増殖.遊走など様々な機能に関与していると報告されている｡また.線維芽細胞はECM を産生する主要な細胞であるが.線維芽細胞のECM産生性に対するECPの影響についての報告はない｡今後は.ECPが線維芽細胞のラミニンやフィブロネクチンなどのECM産生性に及ぼす影響を明らかにすることで.好酸球性炎症の病態をさらに明らかにすることができると考える｡【結論】本研究の結果から.ECPはROCKを介して正常ヒト線維芽細胞の増殖.細胞増殖活岨 アクチン細胞骨格形成.TIMP-1の産生性を冗進することで,好酸球性炎症において,組織の線維化に寄与している可能性が示唆された｡学位論文審査結果の要旨EosinophilCationicProtein(ECP)は活性化した好酸球から放出される好酸球特異頼粒の1つである｡ECPは.タンパク質自体が有する細胞傷害性や様々な生理活性により好酸球性炎症に関わると考えられている｡一方,近年.マウス線維芽細胞にヒトECPを作用させた研究で.ECPは線維芽細胞に細胞傷害性を持たず.その増殖を充進させることを示す報告がなされた｡このことは.ECPが好酸球性炎症で線維芽細胞に対し細胞傷害性を持たず.組織の線維化に関与することを示唆する報告である｡しかし,げっ歯頬は元来ECPを有さないとみられており,ヒトECPに対する線維芽細胞の応答はマウスとヒトで異なる可能性がある｡ヒトECPが正常ヒト線維芽細胞 (normalhumanfibroblastS:NHFs)に及ぼす影響を明らかにすることは.好酸球性炎症の病態を明らかにする上で重要な課題である0本研究ではヒトECPがNHFsに及ぼす影響を調べたcECPによるNHFsの形態変化を観察した.そして.細胞の形態を司る細胞骨格の変化をfilamentous-actin(F･actin)に着目して調べた｡さらに,ECP刺激によるNHFSの増殖とミトコンドリア活性.そして細胞間情報伝達物質の産生への影響についても調べた｡NHFsに対 してECP刺激を行った結果.ECPはNHFsに以下の影響を及ぼした｡1)細胞質を伸展させた2)F-actin量を増加させ (p<0.05),その作用はROCK阻害剤であるY-27632によって抑制された3) 細胞数を増加させ.ミトコンドリア活性も冗進させた (p<0.05)4)細胞間情報伝達物質の産生は.調べた範囲内では顕著な変化はなかった5) tissueinhibitorofmetaloproteinase(TIMP)-1の産生を冗進させた (p<0.05)以上のことから.ECPはROCKを介してNHFsの増殖.ミトコンドリア活性.アクチン細胞骨格形成.そして TIMP-1の産生を冗進することで.好酸球性炎症において組織の線維化に関与 している可能性が示された｡今後は,ECPが線維芽細胞のラミニンやフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス産生に及ぼす影響を明らかにすることで,好酸球性炎症の病態をさらに明らかにすることができると考えられる｡このように.本論文では,好酸球性炎症において組織の線維化をもたらす機序の一部を解明し,今後の研究の方向性を示した｡以上に基づき,審査委員会は本申請論文に博士 (歯学)の学位論文として価値があるものと認めたC

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